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1、<p><p>&lt;p&gt;高效液相色谱讲义 nHPLC原理与仪器 nHPLC分离机制与色谱柱 nHPLC的方法开发 nHPLC定性与定量方法 nHPLC实用技术 ZJU-CHEMZJU-CHEM Prof. Wu JianminProf. Wu Jianmin Section 1 液相色谱原理与仪器 Theory and Instrument n蒸馏 n离心 n电泳（凝胶电泳，毛细管电泳） n过滤 n超滤 n色谱 常见的分离方式 色谱法的分类 HPLC的特点 n高压 n高效 n高速 n高灵敏 问题: HPLC为何会产生
2、高压？高压和高效 间有何关系？ 第二节 色谱基础理论 一一. . 分配系数分配系数 K K 1. 分配系数 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解 、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相 间分配达到平衡时的浓度比，称为分配系数，用K 表示， 即： 分配系数分配系数 K K 的讨论的讨论 ?影响分配系数的因素 -组份本身的性质：极性，基团，疏水性大小等 -固定相的性质（GC，LC） -流动相的性质（LC） -温度（对GC影响显著，对LC的影响不大） 2 2、容量因子与分配系数、容量因子与分配系数 分配系数K：组分在两相间的浓度比； 容量因子k：平衡时，组分在两相中总的质量比；
3、 k =MS / Mm MS为组分在固定相中的质量，Mm为组分在流动相中的质 量。 容量因子k与分配系数K的关系为： 式中为相比。 填充柱相比：635； 毛细管柱的相比：501500 2 2、容量因子的计算、容量因子的计算 容量因子越大，保留时间越长。 可由保留时间计算出容量因子，两者有以下关系： 影响容量因子的因素与影响分配系数的因素相同，外加 相比因素。 两个组份要实现分离的前提条件是： K(A)=K(B) 或 k(A)=k(B) 影响K的因素 ?组分的性质 ?固定相的性质 ?流动相 ?温度 1. 1. 色谱分离过程色谱分离过程 二、塔板理论二、塔板理论- -柱分离效能指标柱分离效能指标
4、2.2.塔板数和塔板高度塔板数和塔板高度 色谱柱长：L， 虚拟的塔板间距离：H， 色谱柱的理论塔板数：n， 则三者的关系为： n = L / H 理论塔板数与色谱参数之间的关系为： 塔板数和塔板高度塔板数和塔板高度 ? 单位柱长的塔板数越多，表明柱效越高。 ? 用不同物质计算可得到不同的理论塔板数。 ? 组分在tM时间内不参与柱内分配。需引入有效塔板数和有 效塔板高度： 3.3.塔板理论的要点：塔板理论的要点： (1)当色谱柱长度一定时，塔板数 n 越大(塔板高度 H 越小)，被测组分在柱内被分配的次数越多，柱效能则越高 ，所得色谱峰越窄。 (2)不同物质在同一色谱柱上的分配系数不同，用有效
5、塔板数和有效塔板高度作为衡量柱效能的指标时，应指明 测定物质。 (3)柱效不能表示被分离组分的实际分离效果，当两组 分的分配系数 K 相同时，无论该色谱柱的塔板数多大，都 无法分离。 (4)塔板理论无法指出影响柱效的因素及提高柱效的途 径。 三、三、 速率理论速率理论- -影响柱效的因素影响柱效的因素 1. 速率方程（也称范.弟姆特Van Deemter方程式）: H = A + B/u + Cu H：理论塔板高度， u：流动相流速 减小A、B、C三项可提高柱效 2. 2. 涡流扩散项涡流扩散项 A A A = 2dp dp：固定相的平均颗粒直径 ：固定相的填充不均匀因子 固定相颗粒越小dp，
6、填充的越均匀，A，H， 柱效n 表现在涡流扩散所引起的色谱峰变宽现象减轻， 色谱峰较窄。但dp，同时引起柱流阻增加 3. 分子扩散项B/UB分子扩散系数 B = 2 Dg (GC) (LC) ：弯曲因子，表示固定相对分子扩散的阻碍作用。 Dg：试样组分分子在流动相（气相）中的扩散系数。 分子扩散导致色谱峰变宽，H(n)，柱效变差。 分子扩散项与流速有关，流速，滞留时间，扩散， 扩散系数：Dg （M载气）-1/2 ； M载气，B值 T? 4.传质阻力项Cu传质阻力系数C 组分在气相和液相两相间进行反复分配时，遇到阻力 。 传质阻力包括流动相传质阻力Cm和固定相传质阻力Cs 。 即： C =（Cm
7、 + Cs） GC中： C =（Cg + Cl）固定相固定相 液膜厚液膜厚 度度 速率理论（与速率理论（与GCGC对比）对比） 1. 1. 图 示 续前 2）传质阻力项及其影响 2. 2. 对于HPLC 1）分子扩散项及其影响 H=A+B/u +Cu 图 示 bac k 5. 填料颗粒直径对柱效的影响 Effect of particle size on the column efficiency Van Deemter Equation of LC: 可见，dp对LC塔板高度有重要影响， 较 小的dp有利于H的降低，提高柱效。目前 HPLC填料的dp大约为2-10um.因此必定产生 较高的柱
8、压。 流动相流速及填料粒径对柱效的影响 Effect of mobile phase velocity of the column efficiency 6. 速率理论的要点 (1) 被分离组分分子在色谱柱内运行的多路径、浓度梯度所造成的分 子扩散及传质阻力使气液两相间的分配平衡不能瞬间达到等因素是造成色 谱峰扩展、柱效下降的主要原因。 (2) 通过选择适当的固定相粒度、载气种类、液膜厚度及载气流速可提 高柱效。 (3) 速率理论为色谱分离和操作条件的选择提供了理论指导。阐明了 流速和柱温对柱效及分离的影响。 (4) 各种因素相互制约，如载气流速增大，分子扩散项的影响减小，使 柱效提高，但同时
9、传质阻力项的影响增大，又使柱效下降；柱温升高，有 利于传质，但又加剧了分子扩散的影响，选择最佳条件，才能使柱效达到 最高。 1. 色谱分离中的四种典型情况 四、四、 分离度（分离度（Resolution)Resolution) 分离效果差，柱效低，选 择性（ ? ）低 完全分离，柱效高，峰窄 ，选择性（ ? ）低 ； 完全分离，选择性（ ? ）增 加，柱效低，峰宽 完全分离，柱效高，选择性 （?）好 R =0.8：两峰的分离程度可达89%； R =1.0：分离程度98%；基本分离 R =1.5：达99.7% 完全分离 2. 2. 分离度定义式分离度定义式 假设Wb(2)=Wb(1)=Wb（相邻
10、两峰的峰底宽近似相等） ，k1k2=k，可导出下式： 3. 3. 色谱分离基本方程式色谱分离基本方程式 选择因子选择因子 规律： ? 塔板理论和速率理论都难以描述难分离物质对的实际分离 程度。即柱效为多大时，相邻两组份能够被完全分离。 ? 难分离物质对的分离度大小受色谱过程中两种因素的综合 影响： 保留值之差选择性色谱过程的热力学因素； 区域宽度柱效色谱过程的动力学因素。 ? 提高 n 和 ? 是提高分离度的有效途径 ? k的范围 1 &amp;lt; k &amp;lt; 10 4.影响分辨率的因素：K，a，N n分辨率的方程 n k 是容量因子，表达了样品与
11、柱填料的作用 强弱。 n a 是选择性系数，描述两化合物分离的好坏 程度。是化学因素。 n N 是理论塔板数，描述色谱峰的谱带展宽程 度。 提高柱效的方法 n色谱柱本身 n减小填料的颗粒度 n找到最佳的流速(根据不同内径) n合适的温度 n降低溶剂的粘度 n增加柱长 其他影响柱效的因素 n柱外效应 n 连接管路 n 进样器、检测器 n进样体积 n进样量 容量因子 k n改变k值的方法 n调节流动相的极性、pH、离子强度等 n梯度淋洗 与峰高的关系与R的关系 选择性系数 a n定义 n a =1 时两组分分不开， n改变a的途径 n 改变固定相 n 改变流动相 n 改变温度 n 改变样品的本身性
12、质 a ，k，N如何控制分辨率? 第三节 HPLC 仪器 1.LC，HPLC，UPLC，Nano-LC 2. HPLC2. HPLC与与GCGC差别差别 相同：兼具分离和分析功能，均可以在线检测 主要差别：分析对象的差别和流动相的差别 n 分析对象 GC： 能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品， 高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及 高聚物的样品不可检测 占有机物的20% HPLC：溶解后能制成溶液的样品，不受样品挥发性和 热稳定性的限制 ，分子量大、难气化、热稳定 性差及高分子 和离子型样品均可检测 。 用途广泛，占有机物的80% 续前 n流动相差别 nGC：流动相为惰性气体 组分与流动相
13、无亲合作用力，只与固定相作用 nHPLC：流动相为液体 流动相与组分间有亲合作用力 HPLC的这一特点为提高柱的选择性、改善分离度增加了因 素，对分离起很大作用。 流动相种类较多，选择余地广 流动相极性和pH值的选择也对分离起到重要作用 选用不同比例的两种或两种以上液体作为流动相 可以增大分离选择性 n操作条件差别 nGC：加温操作 nHPLC：室温；高压（液体粘度大，峰展宽小） 二、二、HPLCHPLC仪器仪器 1 1贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物贮液罐（滤棒，可滤去颗粒状物 质）质） 2 2高压泵（输液泵）高压泵（输液泵） 3 3进样装置进样装置 4 4色谱柱色谱柱分离分离 5 5检测器检测
14、器分析分析 6 6废液出口或组分收集器废液出口或组分收集器 7 7记录装置记录装置 典型的仪器配置 HPLC 仪器系统 nSolvent Reservoir and Degassing System nPumps nSample Injection System nPrecolumns(Option) nColumns nTemperature Control (Option) nDetectors nData process and control system 几种不同型号的HPLC仪器系统 Agilent 1100 HPLC 系统 HPLC instrument 四元梯度系统示意图 Wa
15、ters HPLC 系统 液相色谱仪（液相色谱仪（1 1） 液相色谱仪（液相色谱仪（2 2） 2.主要部件 高压输液泵 主要关键部件之一，压 力：150350105 Pa。 为了获得高柱效而使用 粒度很小的固定相（6 mm are semi or preparative column UPLC vs HPLC HPLC vs UPLC HPLC vs UPLC HPLC检测器 对检测器的要求 n高灵敏度 n可重现的设置 n合适的带宽 n快速或可变的时间常数 n宽的线性响应 n容易使用及保养 n自我诊断功能 衡量检测器的指标 n灵敏度 S = R / Q nR是检测器响应值的增量 nQ是样品量的增量 n噪音 没有样品时检测器的最大输出信号 n漂移 检测器在一段时间内响&lt;/p&gt;</p></p>
