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1、白藜芦醇影响HT-29结肠癌细胞转移侵袭分子机制的初步研究 摘要：探讨白藜芦醇对结肠癌细胞株HT-29侵袭机理蛋白质水平的影响。 用080M白藜芦醇处理HT-29结肠癌细胞24h，采用蛋白质印记技术检测白藜芦醇对Bcl-2、cyclinD1蛋白质水平的影响。运用明胶酶谱法对明胶酶A（MMP-2）和明胶酶B（MMP-9）进行测定其活性。本实验均以-actin为内参进行分析。白藜芦醇处理诱导Bcl-2蛋白质表达量增加、cyclinD1蛋白质表达量减少，-actin蛋白质表达量不变。MMP-2、MMP-9酶活性降低。关键词：白藜芦醇；HT-29细胞；Bcl-2；MMP-2；MMP-9引言：白藜芦醇（
2、Resveratrol，Rev）化学名称为3，4，5-三羟基-反-均二苯代乙烯，分子式C14H12O3，结构如图1.1所示，分子量228.2，以游离态（顺式-、反式-）和糖苷结合态（顺式-、反式-）两种形式存在，是一种植物抗毒素的多酚类活性单体，广泛存在于葡萄、花生、虎杖等植物性食物或药物中。图1.1 白藜芦醇结构式1940年人们首次从毛叶藜芦的根部分离获得白藜芦醇。白藜芦醇作为天然的肿瘤化学预防剂，对肿瘤的起始、促进、发展三个阶段均有抑制作用：能够抗突变、抗氧化、抑制自由基并诱导期药代酶（抗起始活性）；还能抑制环氧化酶（COX）的环氧化酶和过氧化氢酶双重活性，具有很强的抗炎作用（抗促进活性）
3、。还具有抗动脉粥样硬化和冠心病，缺血性心脏病，高血脂的防治作用。近年来肿瘤发病率有上升的趋势。大量的体内、体外抗癌试验结果表明，白藜芦醇对多种肿瘤，如肝癌、乳腺癌、皮肤癌、结肠癌、肺癌等均具有潜在的抗癌活性。鉴于白藜芦醇的潜在抗癌活性，加上和人类饮食关系密切，白藜芦醇已成为肿瘤防治中的研究热点。1. 实验内容 1.1 实验试剂：白藜芦醇 ，1640培养基，GIBCO ，青霉素 ，链霉素 ，L-谷氨酰胺(L-glutamine)，HEPES，PBS ，0.25%胰酶细胞消化液 ，胎牛血清，二甲基亚砜(DMSO) ，1640培养基 ，Western及IP细胞裂解液 ，BCA蛋白浓度测定试剂盒（增强
4、型），SDS-PAGE蛋白上样缓冲液，Acryl/bis solution ，TEMED，Western一抗稀释液 ，脱脂奶粉 ，Actin抗体，Bcl-2抗体，14-3-3抗体，cyclinD1抗体，辣根酶标记山羊抗兔IgG(H+L) ，辣根酶标记山羊抗小鼠IgG(H+L)，过硫酸铵，SDS，Tris，NaCl，Tween-20，甘氨酸，甲醇，Beyo ECL Plus，浓盐酸，米吐尔，对苯二酚，溴化钾，无水亚硫酸钠，无水碳酸钠，硫代硫酸钠，硼酸，钾明矾，Beyo ECL Plus A液，Beyo ECL Plus B液，Tris-Hcl，Trition X-100 ，NaCl，Brij-3
5、5，考马斯亮蓝（R250），乙酸，溴酚蓝，甘油，甲醇 1.2 实验仪器：生物安全柜，二氧化碳培养箱 ，二氧化碳钢瓶，高压蒸汽灭菌锅，电热恒温鼓风干燥箱，TGL-20M台式高速冷冻离心机， 数显恒温水浴锅HH-1，超低温冷冻冷藏柜，MILLIQURE超纯水仪，冷藏冷冻冰箱，电子天平（型号为AL204），电泳仪 ，转膜仪，制冰机，电泳仪 1.3.1 HT-29细胞培养l 细胞培养的准备1）玻璃器皿的清洗和消毒2）金属过滤器及其他器材的消毒3）无菌室的消毒l 细胞培养及传代细胞在含10%胎牛血清的1640培养基中，于5%CO2，37培养箱中常规培养。待细胞长满至培养瓶底面积80%之后传代，全部实验均
6、用指数生长期细胞。传代要根据细胞生长情况而定。传代时间的长短与接种细胞的类型和数量的多少有关，加太稀或太密均影响传代时间。一般接种细胞密度范围为(2.5-5)104细胞数/ml。1.3.2 细胞的处理l RPMI 1640培养液的配制l 白藜芦醇溶液的配制1.3.3 蛋白质浓度测定及标准曲线的制作l BCA检测步骤1） 取1.2ml蛋白标准配制液加入到一管蛋白标准（30mg BSA）中，充分溶解后配制成25mg/ml的蛋白标准溶液。 2）取适量25mg/ml蛋白标准，稀释至终浓度为0.5mg/ml。 3）根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）配制适量BCA工作液，
7、充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。4）将标准品按0，1，2，4，8，12，16，20l加到96孔板的标准品孔中，加标准品稀释液补足到20l。5）加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加标准品稀释液到20l。6）各孔加入200l BCA工作液，37放置20-30分钟。7）测定OD值，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出样品的蛋白浓度。1.3.4 Western blottingl 细胞总蛋白的提取1）取经白藜芦醇白藜芦醇处理过的细胞，吸去培养基，用PBS洗涤，每孔加入90LIP细胞裂解液，作用3分钟，细胞刮刀刮下细胞，吹打使破碎完全，吸取悬液于1.5mLEP管中，离心，
8、取上清，分装，每孔样品做好标记-86保存。2）提取蛋白后使用BCA试剂盒及酶标仪测定提取液蛋白浓度。l 蛋白质SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳1）制样：根据上样量和各个样品蛋白质浓度计算上样体积。加5Loading buffer，吸打混匀，沸水浴加热变性样品15min，冷却至室温即可点样。2）电泳：进行SDS-PAGE，安装好电泳槽，恒压80V，开始电泳，至溴芬蓝距胶底约1厘米左右停止。3）转膜：NC膜在转移缓冲液中浸泡10min；PVDF膜先在甲醇中浸泡30s，再在转移缓冲液中浸泡10min；膜的预处理应在电泳结束前做好，电泳一结束开始转膜。配好的转移缓冲液倒入干净磁盘中，将夹板泡沫泡在缓冲液中，
9、尽量赶出气泡。将胶从电泳槽中小心取出平放泡在磁盘里，除去浓缩胶和两边未点样的分离胶。夹板水平放置，依次放上海绵，大滤纸，小滤纸，分离胶，转移膜，大滤纸，海绵，夹好。按照胶在阴极膜在阳极的方向将装好后放入电泳槽，倒入的缓冲液至少没过胶上端，接通电源进行转移。转膜条件按所转移蛋白质的分子量定，若为小分子，则条件为恒流350mA，60min，若为大分子，则条件为恒流350mA，120min。4）封闭：电泳结束后取出转移膜，蛋白面朝上放在封闭剂的培养皿中，室温摇床低速震荡1小时或48过夜。5）免疫反应：从封闭剂中取出膜，蛋白面朝上置于培养皿中，用TBS-T，室温摇床低速洗涤3次，时间分别为10 min
10、，10min，5 min。一抗：使用一抗稀释液将一抗稀释相应的浓度。使用杂交袋室温摇床孵60min90min或4缓慢摇动过夜。去除一抗：从一抗中取出膜，蛋白面朝上置于培养皿中，用TBS-T，室温摇床低速洗涤3次，时间分别为10min，10min，5min。二抗：使用封闭剂将二抗稀释相应的浓度。使用杂交袋室温摇床孵60min90min。除二抗：从二抗中取出膜，蛋白面朝上置于培养皿中，用TBS-T，室温摇床低速洗涤3次，时间分别为10 min，10 min，5 min。6）感光：取Beyo ECL Plus A液 Beyo ECL Plus B液，根据膜的大小1：1混合，将膜蛋白面朝上铺在保鲜膜上
11、，将混合液均匀滴加在蛋白面上；沥干膜，将膜蛋白面朝下铺在展平的保鲜膜上，四周折回来呈信封状，再将膜蛋白面朝上放置；将膜固定在暗匣中，蛋白面保鲜膜与胶片接触。合上暗匣曝光30s3h；取出胶片，将胶片浸没在显影剂里显影10s3min；从显影液中取出胶片，在自来水中洗涤数次，浸没在定影剂中，1min左右取出；自来水冲洗干净，自然干燥观察结果。1.3.5 明胶酶谱法1）制备75g/L的聚丙烯酰胺凝胶，使用小型电泳糟，凝胶厚度为0.75mm。凝胶聚合后，加入40 g/L浓缩胶。电泳缓冲液为Tris-甘氨酸缓冲液。2）样品与等量加样缓冲液混合，取20l加入加样孔在4下40mA恒流电泳60min。3）电泳结
12、束后，在室温下将凝胶置于25ml/L洗脱液中振荡洗脱2次，每次30分钟，洗去胶中的SDS，恢复酶的活性。4）将凝胶置于孵育缓冲液。5）孵育结束后经染色液，及脱色液脱色显示出MMP-2和MMP-9为位于蓝色背景上的透亮带。6）此凝胶经凝胶成像仪扫描，使用分析软件测定酶分解条带的密度，根据样品中蛋白浓度计算出样品中酶的比活性。在电泳中，同时加入预染的已知分子量的蛋白Mark以计算条带的分子量。2 结果与分析2.1 蛋白质浓度标准曲线把HT-29细胞经不同浓度白藜芦醇（0、10、20、40、60、80mol/L）处理24h后提取的蛋白质进行浓度测定，数据如表2.1所示，得标准曲线如图2.1所示。表2
13、.1 080M白藜芦醇处理的样品里蛋白质浓度标准蛋白量（l）PBS稀释液（l）BCA工作液（l）吸光度（A）0202000.10931192000.13342182000.15174162000.19098122000.25911282000.33611642000.38602002000.4650图2.1 蛋白质浓度标准曲线由表2.1所测定的数据做蛋白质标准曲线如图2.1，曲线的线性回归方程为：y=57.184x-6.6461，线性相关性系数R2=0.9976。该蛋白质的标准曲线，曲线相关度在0.99以上，基本符合实验准确性要求。 2.2 Westen boltting结果 2.2.1 白藜
14、芦醇对Bcl-2蛋白表达的影响 图2.2 不同浓度白藜芦醇处理后对Bcl-2蛋白表达的影响Bcl-2表达的抑制均可导致线粒体膜渗透性的改变甚至破裂，继而引起线粒体细胞色素C的释放，而细胞色素C可以进一步激活caspase-3并诱发凋亡的发生，从而抑制了细胞凋亡。Mahyar-Roemer等在研究中发现HCT116细胞和HCT116Bax-P-细胞经白藜芦醇作用后均出现线粒体膜破裂与细胞凋亡迹象，虽然其中的HCT116Bax-P-细胞的线粒体膜破裂出现相对较晚，凋亡幅度也相对较小，但该结果说明白藜芦醇还可以通过引发Bcl-2家族非依赖性的线粒体损伤而诱导细胞凋亡14。有研究表明结肠癌组织中有不同
15、水平Bag-1和Bcl-2蛋白的高表达，它们可作为结肠癌早期筛选的一项指标，并对疾病的预后有着重要意义。 由图2.2 可知，白藜芦醇对Bcl-2蛋白质表达有抑制作用，因此白藜芦醇能抑制癌细胞的侵袭。2.2.2 白藜芦醇对cyclinD1蛋白表达的影响 图2.3 不同浓度白藜芦醇处理后对cyclinD1蛋白表达的影响现代学者在观察肿瘤的不协调生长和增生时，发现了与细胞周期调控有关的蛋白，并认为肿瘤与细胞周期调控失常有着密切联系。cyclinD1蛋白在各种恶性皮肤肿瘤中的表达显著升高，包括鳞癌、黑色素瘤和恶性纤维组织细胞瘤等。cyclinD1作为细胞周期调节因子之一，其过度表达是多种人类原发性肿瘤的特征，对肿瘤的诊断和预后判断具有重要意义。如图2.3所示，结果表明，白藜芦醇对cyclinD1蛋白质的表达有抑制作用，即可抑制肿瘤的侵袭。2.2.3 白藜芦醇对14-3-3蛋白表达的影响 图2.4 不同浓度白藜芦醇处理后对14-3-3蛋白表达的影响14-3-3蛋白通过与细胞内许多参与细胞凋亡过程的信号蛋白相互作用,从而抑制细胞凋
