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1、第二军医大学 博士学位论文 滋肾丸药代动力学及其配伍机制研究 姓名：蔡飞 申请学位级别：博士 专业：生药学 指导教师：陈万生 2011-06 滋肾丸药代动力学及其配伍机制研究 - 1 - 摘 要 滋肾丸是中医临床上用来治疗良性前列腺增生的经典方剂，由知母、黄柏和肉桂 （10：10：1）三味中药材组成。中药的体内过程和生物转化是中药现代化的重要内 容，研究中药的药代动力学过程对药效物质基础的发现、揭示方剂配伍机制、创新药 物研制和指导临床合理用药都有重要意义。方剂是中医临床用药的主要形式，而配伍 是方剂的核心，因此方剂配伍机制和规律成为方剂研究的关键科学问题。阐明滋肾丸 的药代动力学特征对解释其
2、配伍机制具有重要的研究价值。 本课题以准确、灵敏和高通量的 HPLC-MS/MS 技术为检测手段，以有效组分群 双苯吡酮苷（新芒果苷和芒果苷） 、知母皂苷（知母皂苷 E1、知母皂苷 B-II 和知母皂 苷 B）和生物碱（巴马汀和小檗碱）为研究对象，对滋肾丸的药代动力学特征进行研 究，从药代动力学的角度揭示本方剂的配伍机制。具体内容包括： 一、滋肾丸主要活性成分体内测定方法学的建立 建立灵敏、可靠的 HPLC-MS/MS 方法，同时测定滋肾丸中 7 种主要活性成分的 血药浓度。本方法选择简便、快捷的蛋白沉淀法处理血浆样品，将人参皂苷 Re 与四 氢小檗碱分别作为苷类与生物碱类成分的内标， 并通过
3、离子极性转换技术分别选择灵 敏度最高的监测模式（负离子模式监测双苯吡酮苷与知母皂苷，正离子模式监测生物 碱） 测定理化性质差异较大的各类成分。 通过条件优化， 芒果苷的LLOQ达到5 ng/mL， 新芒果苷、知母皂苷 E1、知母皂苷 B-II 与知母皂苷 B 的 LLOQ 达到 0.5 ng/mL，巴 马汀与小檗碱的 LLOQ 达到 0.05 ng/mL， 在 9 min 内同时完成滋肾丸中 7 种成分的血 药浓度测定。 上述方法应用于大鼠口服滋肾丸提取物后的药代动力学研究。 新芒果苷与芒果苷 的药代动力学参数表现出显著的不同；知母皂苷 E1、知母皂苷 B-II 与知母皂苷 B 有 相似的体内
4、药代动力学参数和药时曲线图，且存在明显的双峰现象；巴马汀和小檗碱 的血药浓度非常低，且药时曲线图出现了多峰现象。上述 HPLC-MS/MS 方法的建立 为后续药代动力学研究提供了良好的检测手段。 二、滋肾丸在大鼠血浆中的比较药代动力学 通过对建立的 HPLC-MS/MS 方法进行适当改变，分别测定不同剂量组口服给药 后的大鼠血浆样品，并将单味药、知母黄柏药对及滋肾丸对大鼠灌胃后所得主要药代 第二军医大学博士学位论文 - 2 - 动力学参数进行比较。 结果表明， 在药对配伍后， 新芒果苷和芒果苷的血药浓度 （Cmax、 AUC0-t）显著减小，表明黄柏起到了降低这两种活性成分血药浓度的作用；而黄
5、柏和 肉桂对知母皂苷 E1、知母皂苷 B-II 和知母皂苷 B 的体内血药浓度整体影响较小；知 母对巴马汀和小檗碱的血药浓度（Cmax、AUC0-t）起到了提升作用，证明了药对配伍 的合理性，肉桂反而抑制了知母的这种作用，从一定程度上体现了肉桂在整个方剂中 的反佐地位。 三、滋肾丸在大鼠前列腺组织中的比较药代动力学 为避免强烈的基质效应干扰，建立脉冲梯度洗脱的 HPLC-MS/MS 方法对 5 种苷 类成分的组织药物浓度进行测定，对生物碱类成分的测定则采用等度洗脱的方法，以 缩短分析周期。通过对滋肾丸主要活性成分在大鼠体内的组织分布研究得出，7 种成 分在组织中的分布速度较快， 在滋肾丸的效应
6、靶器官前列腺中存在相对较高的药 物浓度，且生物碱类成分在大多数组织中的分布浓度远高于血药浓度，这些特点有利 于滋肾丸在治疗前列腺增生症的过程中发挥药理作用。 通过对正常与模型大鼠前列腺组织中 7 种成分的分布比较， 发现除双苯吡酮苷类 成分表现出一定的差异外，其它成分在组织中的分布行为十分接近，表明在后续滋肾 丸的前列腺组织分布实验中以正常大鼠为实验对象即可。 将单味药、药对及滋肾丸提取物对大鼠灌胃后，分别测定 7 种成分的血浆和前列 腺组织浓度。结果表明，双苯吡酮苷类和皂苷类成分在前列腺组织中的分布浓度均低 于对应时间点的血药浓度， 而生物碱类成分在前列腺组织中的分布浓度远高于血药浓 度，
7、从而有利于生物碱类成分在靶器官前列腺中达到足够的药物浓度而发挥药效 作用。总体而言，在单味药组、药对组和滋肾丸组之间，双苯吡酮苷类和皂苷类成分 在前列腺组织中的分布差异小， 表明药对及滋肾丸的配伍对它们在靶器官的分布动力 学影响甚微。与血浆药代动力学的变化规律相似，知母对黄柏中巴马汀和小檗碱的前 列腺组织分布（Cmax、AUC0-t）起到了显著的增强作用，从而有利于提高生物碱类成 分在靶器官的药理作用，但肉桂对知母的这种作用稍显抑制。本结论从组织分布的角 度揭示了知母黄柏药对配伍应用的科学性， 阐述了滋肾丸三味药材配伍应用的中医理 论知母黄柏二药相须而行，肉桂寒因热用，假之反佐。 四、滋肾丸化
8、学成分的体外转运与代谢研究 滋肾丸药代动力学及其配伍机制研究 - 3 - 本实验通过药材提取物在Caco-2细胞单层的转运研究，测定7种成分的表观渗透 系数（Papp值） ，除知母皂苷B外均小于110-6 cm/s，表明它们口服给药时为吸收不良 的药物。发现小檗碱和巴马汀是P糖蛋白（P-gp）的底物，在肠道转运过程中受到P-gp 强烈的外排作用，因而推测这是其口服生物利用度低的重要因素。实验表明芒果苷在 肠道菌群的作用下，代谢为其苷元降阿赛里奥，芒果苷及降阿赛里奥均对肠道P-gp 有抑制作用，因而降低P-gp对其底物巴马汀与小檗碱的外排作用，促进黄柏中这两种 生物碱类成分的肠道转运，从而导致黄
9、柏在与知母配伍后，巴马汀与小檗碱在血浆及 各组织中的分布相应增加。 考察滋肾丸中的21种单体化合物对6种主要P450酶活性的抑制作用， 结果表明， 新芒果苷和芒果苷对CYP2E1有强烈的抑制作用， IC50值分别为0.47 M和0.15 M， 黄柏碱对 CYP2D6 有强烈的抑制作用，IC50值为 0.56 M。三种化合物在不同浓度 （0.5IC50，1IC50）时，均表现为单一型抑制类型的特点，新芒果苷与芒果苷为竞 争性抑制，而黄柏碱为非竞争性抑制。 考察药材提取物在HepG2细胞模型上对6种主要P450酶的诱导作用， 结果表明， 黄柏提取物在 10 g/mL 和 30 g/mL 时对 CY
10、P1A2 的诱导作用均非常显著。进一步 对黄柏中的化学成分予以筛选，基因表达分析结果表明小檗碱在 0.54.5 g/mL 时诱 导作用为对照组的 1.516.1 倍， 巴马汀在 130 g/mL 时诱导作用为对照组的 2.77.2 倍。 小檗碱在 0.54.5 g/mL 时对 CYP1A2 的诱导作用提高至阴性对照的 1.64.9 倍， 诱导能力强于阳性对照 -萘黄酮（1.9 倍） ，巴马汀在 130 g/mL 时对酶的诱导作用 提高至阴性对照的 1.11.7 倍。 临床上滋肾丸与其它药物联合应用时， 在吸收与代谢环节可能存在的药物相互作 用值得注意。 五、滋肾丸中芒果苷和知母皂苷 B-II
11、的药代动力学研究 对大鼠分5、 15、 45和90 mg/kg四个剂量组灌胃芒果苷后， Cmax分别为37.217.8、 86.741.5、93.753.2、151.576.8 ng/mL，AUC0-t分别为 120.746.4、414.8252.5、 521.1296.0、715.2355.5 ng.h/mL，给药剂量与 Cmax和 AUC0-t不呈线性关系，表明 芒果苷口服后在大鼠体内为非线性药代动力学特征。 对大鼠分 0.9、1.8 和 5.4 mg/kg 三个剂量组静注知母皂苷 B-II 后，Cmax分别为 第二军医大学博士学位论文 - 4 - 3976.9188.2、11295.38
12、06.6、49996.59572.3 ng/mL，AUC0-t分别为 833.733.2、 2263.6180.4、12550.62204.2 ng.h/mL，给药剂量与 Cmax和 AUC0-t呈正相关，表明 知母皂苷B-II静注后在大鼠体内为线性药代动力学特征。 对大鼠分30、 90和180 mg/kg 三个剂量组灌胃知母皂苷 B-II 后， Cmax分别为 55.638.4、 432.6353.3、 1644.51242.8 ng/mL，AUC0-t分别为 122.6114.9、330.0218.2、2191.31194.5 ng.h/mL，给药剂量 与 Cmax和 AUC0-t不呈线性
13、关系，AUC0-t随剂量增加而升高较快，可能为非线性消除 所致。 生物利用度研究表明，知母皂苷 B-II 在 SD 大鼠和 Beagle 犬体内的口服生物利 用度很低，分别为 1.1%与 0.71%。 关键词：关键词：滋肾丸，知母，黄柏，肉桂，药代动力学，配伍机制，HPLC-MS/MS 滋肾丸药代动力学及其配伍机制研究 - 5 - Abstract Zishen Pill (ZSP) is a traditional Chinese medicinal formula widely used to treat benign prostatic hyperplasia for a long pe
14、riod of time. The pill contains Anemarrhenae Rhizoma, Phellodendri Amurensis Cortex and Cinnamomi Cortex with a ratio of 10: 10: 1 in weight. The pharmacokinetics of the pill was studied and utilized to elucidate its compatibility mechanism. The content includes five main parts. Firstly, A sensitive
15、 and reliable high performance liquid chromatography-electrospray ionization-tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-MS/MS) has been developed and validated for simultaneous determination of active components, i.e., xanthone glycosides (neomangiferin and mangiferin), timosaponins (timosaponin E1, timosap
16、onin B-II and timosaponin B) and alkaloids (palmatine and berberine) in rat plasma after oral administration of ZSP extract. Plasma samples were pretreated by protein precipitation with acetonitrile containing the internal standards ginsenoside Re (for xanthone glycosides and timosaponins) and tetrahydroberberine (for alkaloids). LC separation was achieved on a Zorbax SB-C18 column (150 mm
