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1、中国人民解放军军医进修学院;中国人民解放军总医院 硕士学位论文 拓扑替康对HPB-AM细胞增殖及MAGE基因表达影响的研究 姓名:雷琦 申请学位级别:硕士 专业:儿科学 指导教师:唐锁勤 20070531 军医进修学院硕士学位论文 英文缩写词表 英文名称 M e l a n o m aa n t i g e n e n c o d i n g T u m o r - a s s o c i a t e da n t i g e n t u m o r 响e c t i o na n t i g e n c y t u t o x i c i t yTl y m p h o c y t e T
2、o p o t e c a n r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t u m o r - s p e c i f i ca n t i g e n C a m p t o t h e c i n t u p o i s o m e r a s e1 f e t a lc a l fs e r u m d i m e t h y I s u l f o x i d e 3 ( 4 ,5 d i m t h y - 2 2 t h i a z o l y ) 2
3、,5 一d i p h e n y - 2 1 - 1 - t e t r a z o l i u nb r o m i d e D i e t h y ip y r o c a r b o n a t e M e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d e t h i d i u mb r o m i d e G l y c e r a l d e h y d e s 3 p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e C o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u
4、 c l e i ca c i d B a s ep a i r O p t i c a ld e n s i t y n b o n u c l e a s e d i t h i o t h r e i t o R o t a t ep e rm i n u t e p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n 中文名称 黑色素瘤抗原 肿瘤相关性抗原 肿瘤摊斥抗原 细胞毒性T 淋巴细胞 拓扑替康 逆转录聚合酶链反应 肿瘤特异性抗原 喜树碱 D N A 拓扑异构酶I 胎牛血清 二甲基亚砜 四甲基偶氮唑盐 焦炭酸二乙酯 信使核糖核酸 溴化乙锭 甘油醛3
5、 磷酸脱氢酶 互补脱氧核糖核酸 碱基对 光密度 核糖核酸酶 二硫苏糖醇 每分钟转速 磷酸缓冲液 一一眦瞰吼研一儆州麟一一 一一髓一一印哪 呻哦 军医进修学院 研究生学位论文原创性声明 秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新”的学风,本人声明:所呈交的论文 是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知,除了文中 特别加以标注和致谢的地方外,论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过 的研究成果,也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材料, 对本文的研究作出贡献的个人或集体。均以在文中做了明确的说明并表示谢意。 本人承担一切相关责任。 闩期:砷j 3J 日期:D 7 r 军
6、医进修学院 研究生学位论文版权使用授权书 本人保证毕业离校后,发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医进修 学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复 印件和电子版本,可以采用影印、缩印、扫描或其他手段保存论文以供被查阅和 借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) 。 论文作者签名:嗜磷 只期:砷j ,j J 指导教师签名:气勺秽殇 日期:0 7 G 厂 军医进修学院硕L 学位论文 拓扑替康对咿B 棚细胞增殖及姒G E 基因表达影响的研究 中文摘要 背景:黑色素瘤抗原( M e l a n o m aa n t i g e n e n c o
7、d i n g ,V I A G E ) 是第一个从黑 色素瘤中发现的一组肿瘤相关性抗原( t u m o r - a s s o c i a t e da n t i g e n ,T A A ) 人类 M A G E 基因家族编码的肿瘤排斥抗原( t u m o rf c j e c t i o na n t i g e n , I R A ) 在细胞内 经加工产生抗原肽,并与H L A - 1 类分子结合形成复合物,能诱导自体细胞毒性T 淋巴细胞( c y t o t o x i c i t yTl y m p h o c y t e ,C T L ) 特异性识别,诱导其对相应肿瘤细 胞
8、的特异性杀伤。M A G E 基因在许多恶性肿瘤中都有较高的表达,而在正常组 织( 除胎盘滋养层及睾丸精原细胞之外) ,炎症组织及良性肿瘤组织中均无表达, 因而被认为是肿瘤特异性的,可用于肿瘤的分子学诊断和免疫治疗初步的临床 实验已证实了该M A G E 基因在抗肿瘤治疗中的意义 拓扑替康( T o p o t e c a n ,1 1 叮) 是细胞核拓扑异构酶I 的独特而有效的抑制荆, 它通过与D N 拓扑异构酶I 聚合物形成稳定的共价复合物来发挥其抗肿瘤作 用近来发现它对多种难治性实体肿瘤尤其对部分血液系统肿瘤有效,单用 t o p o t e c a n 治疗复发,难治非霍杰金淋巴瘤有效
9、率达4 0 虽然 T 在治疗白血 病淋巴瘤等恶性血液病的临床实验中已显示了明显的抗肿瘤活性,但对其作用 的分子机理尚不清楚。耵呵对淋巴瘤细胞的作用及其与M A G E 基因之间的关系 有待探讨本实验旨在研究T P T 诱导T 细胞淋巴瘤系H P B A M 细胞株凋亡的作 用及1 r I r r 作用与M A G E 基因之间的关系,为进一步了解1 1 y l r 对肿瘤细胞的作用 机制,提高1 r I y l r 的临床疗效提供有意叉的实验资料。 方法: 1 本研究以T 细胞淋巴瘤系H P B - A M 细胞株为研究对象,采用半定量逆转 录- 聚合酶链反应( r e v e r s et
10、r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ,R T - P C R ) 方法 在m R N A 水平检测M A G E 1 M A G E - 2 。M A G E - 3 。M A G E - 4 基因的表达情况 2 采用四甲基偶氮唑盐光吸收法( M T r 法) 检测不同浓度( 0 m o l L , 0 0 5 z m o l L ,0 1 毗m o l L ,0 1 舡m o l f L ,0 2 0 M m o l L ) 研T 作用于H P B - A M 细胞 株不同时间后( 0 4
11、 8 、1 2 、1 6 小时) 的增殖情况,计算各组细胞的增殖抑制 率,并确定1 1 y l r 抑制H P B - A M 细胞增殖的最小有效浓度和最短作用时间倒置 显微镜下观察细胞生长状态及形态学改变 2 军医进修学院硕I :学位论文 3 采用半定量R T - P C R 方法在m R N A 水平检测1 甲T 对H P B A M 细胞株 M A G E 基因表达的影响 4 应用S P S S l 0 0 统计软件进行统计学处理,统计学数据用均数标准差( 工丛) 表示两样本均数的比较采用独立样本的T 检验,多样本均数的比较采用单因 素方差分析重复5 次独立试验,检验水准以P 值 0 0
12、 5 为差异有显著性 结果: 1 H P B A M 细胞M A G E 基因的表达M A G E - 3 的表达水平为0 9 4 - - * 0 0 3 , M A G E 4 的表达水平为0 8 5 0 0 1 ,M A G E 1 M A G B 2 均无表达。 2 m 对H P B - A M 细胞株增殖的抑制作用 采用M T r 比色法检测结果:不同浓度( 0 9 m o l L , 0 0 5 9 m o l L ,0 1 0 u m o l L , O 1 5 9 m o I L ,0 2 0 u m o l L ) T P l r 作用H P B - A M 细胞不同时间( 4
13、 ,8 ,1 2 ,1 6 小 时) ,其对H P B A M 细胞的抑制作用随浓度的增高而逐渐增强,随时问的延长而 逐渐增强最小有效浓度为0 1 0 t m 0 1 I _ , ,浓度为0 1 5 a m o l F L 时抑制作用明显, 达到0 2 0 z m o l L 时抑制作用不再增加;最短作用时间为8 小时,1 2 小时抑制作 用明显增强,超过1 6 小时抑制作用不再增加空白对照组抑制率无变化 T P T 作用细胞后的形态学改变:浓度0 1 0 “m o l I , 的1 r I r r 作用H P B - A M 细胞1 2 h 后,倒置显微镜下观察发现细胞集落减少,细胞中颗粒增
14、多,细胞碎片 增多,而1 r I 叮作用前细胞均呈悬浮生长,细胞轮廓清楚,生长旺盛。 3 啪对H P B - A M 细胞M A G E 基因表达的影响 R T - P C R 结果显示: 当唧浓度, , - , 9 ( 0 9 m o l L ,0 0 5 M m o l L ,0 1 0 9 m o l L ,0 1 5 9 m o l L ,0 2 0 a m o F L ) , 作用1 2 小时时,M A G E - 3 基因相对表达量随矸T 浓度增加而减少,分别为 O 9 4 0 0 3 、O 8 7 如0 5 、0 7 8 - + 0 0 3 、0 6 5 o 0 5 、0 5 9
15、 _ - * 0 0 6 在浓度为0 1 0 , t m o l ,L 时基因表达明显受抑( p = 0 0 2 9 9 ) T P T 浓度为0 1 0 p m o l L ,作用0 、4 ,8 、1 2 ,1 6 小时时M A G E - 3 表达分别 为O 9 4 0 0 3 、O 8 6 蜘0 4 、0 7 7 _ + 0 0 3 、0 6 5 o 0 5 、0 5 9 _ + 0 0 3 ,在作用时问为8 小 时时基因表达明显受抑( p - - - 0 0 1 4 0 ) 当1 1 P T 浓度为( 0 # m o l L ,0 0 5 z m o l L ,0 1 0 # m o l L ,O 1 5 # m o l L ,O 2 0 n n o l L ) , 作用1 2 小时时,M A G E - 4 基因相对表达量随1 1 y l r 浓度增加而减少,分别为 军医进修学院硕上学位论文 0 8 6 _ * 0 0 1 、0 7 7 _ - + 0 0 4 、0 6 1 - 0 0 5 、0 5 0 2 0 0 2 、0 4 5 0 0 3 在浓度为0 1 0 肛m o l L 时基因表达明显受抑( p = 0 0 0 1 1 ) 1 1 y r 浓度为O 1 0 # m o l L ,作用0 ,4 ,8 ,1 2 、1 6 小时时M A G E -