《拓扑替康对hpbam细胞增殖及mage基因表达影响的研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《拓扑替康对hpbam细胞增殖及mage基因表达影响的研究（51页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、中国人民解放军军医进修学院;中国人民解放军总医院 硕士学位论文 拓扑替康对HPB-AM细胞增殖及MAGE基因表达影响的研究 姓名：雷琦 申请学位级别：硕士 专业：儿科学 指导教师：唐锁勤 20070531 军医进修学院硕士学位论文 英文缩写词表 英文名称 M e l a n o m aa n t i g e n e n c o d i n g T u m o r - a s s o c i a t e da n t i g e n t u m o r 响e c t i o na n t i g e n c y t u t o x i c i t yTl y m p h o c y t e T
2、o p o t e c a n r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n t u m o r - s p e c i f i ca n t i g e n C a m p t o t h e c i n t u p o i s o m e r a s e1 f e t a lc a l fs e r u m d i m e t h y I s u l f o x i d e 3 ( 4 ，5 d i m t h y - 2 2 t h i a z o l y ) 2
3、，5 一d i p h e n y - 2 1 - 1 - t e t r a z o l i u nb r o m i d e D i e t h y ip y r o c a r b o n a t e M e s s e n g e rr i b o n u c l e i ca c i d e t h i d i u mb r o m i d e G l y c e r a l d e h y d e s 3 p h o s p h a t ed e h y d r o g e n a s e C o m p l e m e n t a r yd e o x y r i b o n u
4、 c l e i ca c i d B a s ep a i r O p t i c a ld e n s i t y n b o n u c l e a s e d i t h i o t h r e i t o R o t a t ep e rm i n u t e p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n 中文名称 黑色素瘤抗原 肿瘤相关性抗原 肿瘤摊斥抗原 细胞毒性T 淋巴细胞 拓扑替康 逆转录聚合酶链反应 肿瘤特异性抗原 喜树碱 D N A 拓扑异构酶I 胎牛血清 二甲基亚砜 四甲基偶氮唑盐 焦炭酸二乙酯 信使核糖核酸 溴化乙锭 甘油醛3
5、 磷酸脱氢酶 互补脱氧核糖核酸 碱基对 光密度 核糖核酸酶 二硫苏糖醇 每分钟转速 磷酸缓冲液 一一眦瞰吼研一儆州麟一一 一一髓一一印哪 呻哦 军医进修学院 研究生学位论文原创性声明 秉承我院“敬业、勤奋、求实、创新”的学风，本人声明：所呈交的论文 是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他个人或集体已经发表或撰写过 的研究成果，也不含为获得我院或其他教育机构的学位及证书而使用过的材料， 对本文的研究作出贡献的个人或集体。均以在文中做了明确的说明并表示谢意。 本人承担一切相关责任。 闩期：砷j 3J 日期：D 7 r 军
6、医进修学院 研究生学位论文版权使用授权书 本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为军医进修 学院或解放军总医院。学院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文原件、复 印件和电子版本，可以采用影印、缩印、扫描或其他手段保存论文以供被查阅和 借阅。学院可以公布学位论文的全部或部分内容( 保密内容除外) 。 论文作者签名：嗜磷 只期：砷j ，j J 指导教师签名：气勺秽殇 日期：0 7 G 厂 军医进修学院硕L 学位论文 拓扑替康对咿B 棚细胞增殖及姒G E 基因表达影响的研究 中文摘要 背景：黑色素瘤抗原( M e l a n o m aa n t i g e n e n c o
7、d i n g ，V I A G E ) 是第一个从黑 色素瘤中发现的一组肿瘤相关性抗原( t u m o r - a s s o c i a t e da n t i g e n ，T A A ) 人类 M A G E 基因家族编码的肿瘤排斥抗原( t u m o rf c j e c t i o na n t i g e n ， I R A ) 在细胞内 经加工产生抗原肽，并与H L A - 1 类分子结合形成复合物，能诱导自体细胞毒性T 淋巴细胞( c y t o t o x i c i t yTl y m p h o c y t e ，C T L ) 特异性识别，诱导其对相应肿瘤细 胞
8、的特异性杀伤。M A G E 基因在许多恶性肿瘤中都有较高的表达，而在正常组 织( 除胎盘滋养层及睾丸精原细胞之外) ，炎症组织及良性肿瘤组织中均无表达， 因而被认为是肿瘤特异性的，可用于肿瘤的分子学诊断和免疫治疗初步的临床 实验已证实了该M A G E 基因在抗肿瘤治疗中的意义 拓扑替康( T o p o t e c a n ，1 1 叮) 是细胞核拓扑异构酶I 的独特而有效的抑制荆， 它通过与D N 拓扑异构酶I 聚合物形成稳定的共价复合物来发挥其抗肿瘤作 用近来发现它对多种难治性实体肿瘤尤其对部分血液系统肿瘤有效，单用 t o p o t e c a n 治疗复发，难治非霍杰金淋巴瘤有效
9、率达4 0 虽然 T 在治疗白血 病淋巴瘤等恶性血液病的临床实验中已显示了明显的抗肿瘤活性，但对其作用 的分子机理尚不清楚。耵呵对淋巴瘤细胞的作用及其与M A G E 基因之间的关系 有待探讨本实验旨在研究T P T 诱导T 细胞淋巴瘤系H P B A M 细胞株凋亡的作 用及1 r I r r 作用与M A G E 基因之间的关系，为进一步了解1 1 y l r 对肿瘤细胞的作用 机制，提高1 r I y l r 的临床疗效提供有意叉的实验资料。 方法： 1 本研究以T 细胞淋巴瘤系H P B - A M 细胞株为研究对象，采用半定量逆转 录- 聚合酶链反应( r e v e r s et
10、r a n s c r i p t i o n - p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，R T - P C R ) 方法 在m R N A 水平检测M A G E 1 M A G E - 2 。M A G E - 3 。M A G E - 4 基因的表达情况 2 采用四甲基偶氮唑盐光吸收法( M T r 法) 检测不同浓度( 0 m o l L ， 0 0 5 z m o l L ，0 1 毗m o l L ，0 1 舡m o l f L ，0 2 0 M m o l L ) 研T 作用于H P B - A M 细胞 株不同时间后( 0 4
11、 8 、1 2 、1 6 小时) 的增殖情况，计算各组细胞的增殖抑制 率，并确定1 1 y l r 抑制H P B - A M 细胞增殖的最小有效浓度和最短作用时间倒置 显微镜下观察细胞生长状态及形态学改变 2 军医进修学院硕I ：学位论文 3 采用半定量R T - P C R 方法在m R N A 水平检测1 甲T 对H P B A M 细胞株 M A G E 基因表达的影响 4 应用S P S S l 0 0 统计软件进行统计学处理，统计学数据用均数标准差( 工丛) 表示两样本均数的比较采用独立样本的T 检验，多样本均数的比较采用单因 素方差分析重复5 次独立试验，检验水准以P 值 0 0
12、 5 为差异有显著性 结果： 1 H P B A M 细胞M A G E 基因的表达M A G E - 3 的表达水平为0 9 4 - - * 0 0 3 ， M A G E 4 的表达水平为0 8 5 0 0 1 ，M A G E 1 M A G B 2 均无表达。 2 m 对H P B - A M 细胞株增殖的抑制作用 采用M T r 比色法检测结果：不同浓度( 0 9 m o l L , 0 0 5 9 m o l L ，0 1 0 u m o l L ， O 1 5 9 m o I L ，0 2 0 u m o l L ) T P l r 作用H P B - A M 细胞不同时间( 4
13、 ，8 ，1 2 ，1 6 小 时) ，其对H P B A M 细胞的抑制作用随浓度的增高而逐渐增强，随时问的延长而 逐渐增强最小有效浓度为0 1 0 t m 0 1 I _ , ，浓度为0 1 5 a m o l F L 时抑制作用明显， 达到0 2 0 z m o l L 时抑制作用不再增加；最短作用时间为8 小时，1 2 小时抑制作 用明显增强，超过1 6 小时抑制作用不再增加空白对照组抑制率无变化 T P T 作用细胞后的形态学改变：浓度0 1 0 “m o l I , 的1 r I r r 作用H P B - A M 细胞1 2 h 后，倒置显微镜下观察发现细胞集落减少，细胞中颗粒增
14、多，细胞碎片 增多，而1 r I 叮作用前细胞均呈悬浮生长，细胞轮廓清楚，生长旺盛。 3 啪对H P B - A M 细胞M A G E 基因表达的影响 R T - P C R 结果显示： 当唧浓度, , - , 9 ( 0 9 m o l L ，0 0 5 M m o l L ，0 1 0 9 m o l L ，0 1 5 9 m o l L ，0 2 0 a m o F L ) ， 作用1 2 小时时，M A G E - 3 基因相对表达量随矸T 浓度增加而减少，分别为 O 9 4 0 0 3 、O 8 7 如0 5 、0 7 8 - + 0 0 3 、0 6 5 o 0 5 、0 5 9
15、 _ - * 0 0 6 在浓度为0 1 0 , t m o l ，L 时基因表达明显受抑( p = 0 0 2 9 9 ) T P T 浓度为0 1 0 p m o l L ，作用0 、4 ，8 、1 2 ，1 6 小时时M A G E - 3 表达分别 为O 9 4 0 0 3 、O 8 6 蜘0 4 、0 7 7 _ + 0 0 3 、0 6 5 o 0 5 、0 5 9 _ + 0 0 3 ，在作用时问为8 小 时时基因表达明显受抑( p - - - 0 0 1 4 0 ) 当1 1 P T 浓度为( 0 # m o l L ，0 0 5 z m o l L ，0 1 0 # m o l L ，O 1 5 # m o l L ，O 2 0 n n o l L ) ， 作用1 2 小时时，M A G E - 4 基因相对表达量随1 1 y l r 浓度增加而减少，分别为 军医进修学院硕上学位论文 0 8 6 _ * 0 0 1 、0 7 7 _ - + 0 0 4 、0 6 1 - 0 0 5 、0 5 0 2 0 0 2 、0 4 5 0 0 3 在浓度为0 1 0 肛m o l L 时基因表达明显受抑( p = 0 0 0 1 1 ) 1 1 y r 浓度为O 1 0 # m o l L ，作用0 ，4 ，8 ，1 2 、1 6 小时时M A G E -
