海洋棘皮动物锚参抗肿瘤活性物质的研究

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1、墨宁王t 奎毒爵t 曲蕞术暑露耳焉酱蜃术奎议语文毒 2 0 0 6 8 2 - 6 验。但1 9 9 6 年以后，没有一个新的模版或新颖的结构被发现或被应用，大多数天然产物或天然产物来 源的临床药物均来源于相对较老的模版。这与近l O 年来，制药公司显著减少对天然产物的筛选相吻合。 这种巧合说明发现新的先导化合物的难度增加。同时也说明放弃从天然产物中选药也许是制药行业的 一种损失。这给海洋天然药物的发展带来了锲机。我们理应坚定研发海洋天然药物的信心。 第一个海洋药物是以上世纪5 0 年代从加勒L t 海海绵C r y p t o t h e c a c ，y p ，d 分到的C - 核苷阿糖尿

2、苷， 阿糖胸苷为模版台成的阿糖胞苷。系统研究海洋活性物质开始于上世纪7 0 年代中期，1 9 7 1 9 8 7 年， 有2 5 0 0 种新海洋生物代谢产物被发现。表明与陆生生物相比，海洋生物是产生活性化台物的重要的来 源。1 9 8 7 2 0 0 5 年，发现了约】3 0 0 0 种新海洋活性物质。目前，有1 2 个海洋天然产物成为临床试验的抗 肿瘤药物。 微生物由于其种类繁多、繁殖速度快、适应能力强、可与动植物互惠共生，可能是海洋动植物活 性物质的真正生产者；可在人工条件下，实现大规模生产，从而解决药源问题；微生物代谢产物复杂、 多样，成为适宜的药物先导化合物的筛选源， 本次报告将汇报

3、我们实验室近年来采用的微生物药物先导化舍物的筛选方法及获得的8 类重要化 合物。 海洋棘皮动物一锚参抗肿瘤活性物质的研究 沈先荣，蒋定文，陈伟，刘李娜，贾福星，缪辉南 ( 海军医学研究所海洋生物研究中，心，上海2 0 0 4 3 3 ) 籀要：以海参纲中的无足目锚参为原料，采用盐溶液抽提，硫酸胺分级沉淀，D E A E S e p h a r o s e C L - 6 B 离子交换层析，S e p h a c r y lS 3 0 0 分子筛层析，Z O R B A XG F - 2 5 0 柱H P L C 层析，得到海洋锚参 抗肿瘤因子( P r o t a n l y r a B i

4、d e n t a t a A n t i t u m o r F a c t o r , P B A T F ) 。采用垂直平板S D S P A G E 电泳，海洋锚 参抗肿瘤因子染色显示一条带，说明达到电泳纯。P B A T F 用反相Z O R B A XE c l i p s eC D B c 8 柱H P L C 鉴定其纯度，仅显示一明显的吸收峰，说明达到较高纯度。用紫外可见分光光度计进行全波长扫描， 结果P B A T F 在2 8 0 r i m 处有最大吸收峰。 选择人胃癌细胞7 9 0 1 、人子宫颈癌细胞H e l a 和人非小细胞肺癌细胞N C I 为研究对象，小鼠皮肤

5、 成纤维细胞9 2 9 和小牛主动脉血管内皮细胞( B a E C ) 为对照。用M T T 法测定P B A T F 细胞生长的效应， 结果显示P B A q T 对三种肿瘤细胞均具有显著的生长抑制效应，并有明显的剂量依赖关系，而对正常 细胞小鼠成纤维细胞和小牛主动脉血管内皮细胞只在高浓度时有抑制作用，在低浓度时无明显影响。 选择人子宫颈癌细胞H e l a 为研究对象，小鼠皮肤成纤维细胞9 2 9 为对照。观察P B A T F 对细胞集落形 成和集落生长的效应，结果显示P B A T F 对H e l a 细胞的集落形成与生长具有明显的抑制作用，高浓度 3 2 0 # g m l 时无可

6、见的集落形成，低浓度8 0 p g m l 时集落形成数量与集落大小比生理盐水对照组0 k t g m l 非常显著减少，丙对小鼠9 2 9 细胞，高浓度3 2 0 p g m l 时可见的许多集落形成，但集落很小，低浓度 8 0 1 t g m l 时集落形成数量与集落大小与生理盐水对照组比较无明显变化。提示海洋锚参抗肿瘤因子对 肿瘤细胞的集落形成与生长均有非常显著的抑制作用，对皮肤成纤维细胞的集落形成无明显影响，但 高浓度时抑制其集落的生长。 观察P B A T F 对小鼠L e w i s 臃癌、小鼠H 2 2 肝癌、人体肺癌肿瘤L A X 、人体肝癌肿瘤Q G Y 及大 鼠W a l

7、k e r - 2 5 6 癌肉瘤生长的抑制效应，结果显示P B A T F 对小鼠L e w i s 肺癌腋皮下接种模型的疗效， 高剂量组5m g k gi p x 8 q d 方案具有5 6 8 9 的抑瘤率，中剂量组1m g k gi p S q d 方案的抑瘤率为 譬- 土连套毋痞洱生蕞木与海译罨吾学术套议语文摹 2 0 0 6 8 2 - 6 5 2 0 0 ，低剂量组0 5m g k gi p x 8 q d 方案的抑瘤率为3 3 6 1 ；对大鼠W a l k e r - 癌肉瘤腋皮下接种模型 的疗效，高剂量组5m g & gi p x 8 q d 方案具有6 4 1 5 的抑瘤

8、率，中剂量组lm g k gi p x 8 q d 方案的抑瘤 率为5 5 8 2 ，低剂量0 5m s d k gi p x 8 q d 方案的抑瘤率为4 4 0 5 ：对人体肺腺癌L A X 腋皮下接种模 型的疗效，高剂量组5m g k gi p x S q d 方案具有5 6 0 2 的抑瘤率中剂量组lm g k gi p x S q d 方案的抑 瘤率为5 0 6 0 。低剂量组0 5m g k gi p 8 q d 方案的抑瘤率为4 0 3 6 ；对人体肝癌Q G Y 腋皮下接种 模型的疗效，高剂量组5 m g k gi p x S q d 方案具有5 2 0 7 的抑瘤率，中剂量组

9、1m g k gi p x 8 q d 方案的 抑瘤率为4 8 3 1 ，低剂量组0 5 m g k gi p x S q d 方案的抑瘤率为3 3 1 4 ：对小鼠肝癌H 2 2 腋皮下接种 模型的疗效，高剂量组5 m g k gi p x l O q d 方案具有5 9 2 5 的抑瘤率，中剂量组1m g k g p x i O q d 方案 的抑瘤率为5 7 7 4 。低剂量组0 5m g k gi p x1 0 q d 方案的抑瘤率为4 5 2 8 。 应用L D 5 0 方法进行急性毒性实验。结果显示P B A I F 腹腔注射给药，小鼠的L D 5 0 为1 9 7 3 9 k g

10、 ， S x 5 0 = 0 0 2 1 ；其9 5 可信1 7 9 4 2 1 6 9 9 k g 。动物死亡经解剖肉限可见，动物腹腔有积水，心肺肝肾 等主要脏器充血。 此外，我们将锚参以7 5 的乙醇水溶液浸泡提取，提取物用真空干燥器抽干后分散在纯水中，先 后以乙酸乙酯和正丁醇萃取。正丁醇溶解部分首先进行硅胶色谱分离，然后进行S e p h a d e xL H 2 0 的凝 胶色谱分离，重结晶，在反相H P L C ( 7 ：3 的甲醇水体系) 上进行纯化。最后获得一种新的磺化甾 醇P r o t a n k y r a s t e r o l A 。通过N M R 、M S 等多种波谱

11、数据的解析和与已知化台物s t e l l a s t e r o l 对照，最终 确定了此种新的烯醇式磺化甾醇的结构。 M T T 方法检测表明，不同浓度的P r o t a n k y r a s t e r o l A 对癌细胞均有一定的抑制作用。浓度达9 p _ g m l 时，对H e l a 细胞的抑制率为9 7 2 3 ，对N C I h 6 细胞的抑制率为5 9 9 8 ，对9 2 9 细胞的抑制率为 2 3 1 6 。计算 r o m n k y r a s t e r o lA 对H e l a 、N C l - h 6 和9 2 9 细胞的半数抑制率( I C s o )

12、 分别为3 24 - 0 5 I t g m l ，7 7 1 ：0 7p g m l 和3 5 6 士0 7 I _ I g m l 。 P r o t a n k y r a s t e r o l A 作用于H e l a 细胞2 4h 后，随着样品浓度的增大。细胞凋亡率增加：在最高浓 度点( 1 8 I _ t g m 1 ) 时。细胞凋亡率达到6 2 5 5 。H e l a 细胞被不同浓度P r o t a n k y r a s t e r o l A 作用1 6h 后， 迸行流式细胞仪分析。结果表明：随着药物浓度的增加，细胞生存率下降；细胞凋亡加死亡率上升： 随着药物浓度的增加

13、，明显看到细胞由早期凋亡向晚期凋亡，再到死亡的变化趋势；在第三和第四浓 度点( 半数抑制率附近) ，明显出现早期凋亡现象，且基本无细胞坏死，证明了药物的诱导凋亡作用， 而无致坏死作用；随着药物浓度的增加早期细胞凋亡率先上升后下降，呈蜂形变化。 关键词：锚参；小鼠L e w i s 肺癌：小鼠1 4 _ 2 2 肝癌；人体肺癌肿癌L A x ；人体肝癌肿瘤Q G Y ；大鼠 W a l k e r - 2 5 6 癌肉瘤：细胞凋亡 肿瘤是一种常见病，且发病率不断升高，已成为我国人口的第二位死因。目前临床上尽管有手术、 放疗、化疗和生物疗法等治疗手段，但肿瘤的防治河题还是未解决。化学合成药长期以来

14、占据着肿瘤 药物市场的主导地位，然而由于化疗药物的毒副作用大，在杀伤肿瘤组织细胞的同时，对人体正常的 组织细胞也有破坏作用，因此研究开发高效低毒的新型天然抗肿瘤药物已经引起了国内外同行的广泛 关注。长期以来，陆生生物一直是天然药物的重要来源，据估计大约有5 0 以上的药物是从陆地生 物资源衍生丽来相比较而言，海洋虽然占据了地球表面约四分之三的面积但以往人类以研究开发 海洋资源而发现新药的努力却要少得多，因此，从海洋生物中寻找而获得的海洋药物也少得可怜。地 球上物种约有8 0 ( 4 0 多万种) 生活在海洋中，由于其生存环境的特殊性( 高压、高盐、缺氧、缺 阳光等) ，很多海洋生物在长期的进化

15、过程中能够产生一些化学结构新颖独特并且具有特殊生理活 性和功效的物质，这给我们开发新药提供了丰富的资源。 棘皮动物全部生活在海洋中，在无脊椎动物分类系统中，地位很高，成体为辐射对称。但幼体两 侧对称，早期胚胎发育和高等动物相似且具有发达的体腔。这类动物个体一般较大，数量也较多， 3 l t 宁土t奎国嘻耳t 杖术与略讳焉季术奎议奄文暴 2 0 0 6 8 2 - 6 是研究海洋药物良好的资源之一。尤其对棘皮动物中的海参国内外研究工作做的较多。海参在我国 一向视为养生佳品。明代以后，海参收入本草列为补益药，本草从新上谓海参“补肾益精、壮阳 疗瘘”。随息居饮食谱则称海参具有“滋阴、补血、健阳、润燥

16、调经、养胎、利产等功效。本 草纲目拾遗载有海参“补肾经、益精髓、消痰涎、摄小便、壮阳，生百脉血，治溃疡生蛆。”早在6 0 年代，国外有人发现用海参治疗皮肤癌，据称疗效可达5 0 - 6 0 。我国中医人员在7 0 年代将海参单方 或组方治疗癌症可使瘤体缩小，体质改善。近半个世纪以来，国内外运用现代科技手段对海参进行了 广泛而深入的研究，海参体壁是海参主要药( 食) 用部位，主要由上皮和真皮结缔组织问充填着胶元 等纤维成分和蛋白聚糖，以及其它糖蛋白等细胞外基质。干燥体壁有机成分中的蛋白质( 多肽) 高达 9 0 ，脂质约为4 ，多( 寡) 糖占6 左右另有少量的核酸。无机成分中含钙、镁盐及铁、锰、 锌、铜、铝、硒等微量元素。海参蛋白以胶原蛋白为主体，可与传统中药中的补胶如阿胶、龟板胶、 鳖甲胶、鹿角胶在成分