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1、华中科技大学 博士学位论文 新型溶瘤腺病毒M1体内应用的效应和安全性研究及靶向性输送 的探索 姓名：黄晓园 申请学位级别：博士 专业：妇科肿瘤 指导教师：马丁 20070501 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 摘摘 要要 第一部分第一部分 腺病毒腺病毒 Adv-GFP 经不同给药方式进入经不同给药方式进入 BALB/c 鼠鼠 体内后的组织分布和代谢体内后的组织分布和代谢 【目的】【目的】 研究重组腺病毒 Adv-GFP 分别经由尾静脉注射和腹膜后注射进入小鼠体内 后的组织分布和代谢，以评价重组腺病毒载体与肝移植结合治疗肝癌的可行性
2、和安全 性。 【方法】【方法】 分别采取尾静脉注射和腹膜后注射纯化重组腺病毒 Adv-GFP 建立动物模型, 以绿色荧光蛋白（green fluorescence protein，GFP）表达作为指示观察腺病毒的组织 分布，并定量分析荧光强度；用原位杂交法比较各器官的腺病毒转录水平；定量检测 病毒注射后不同时间点血清和肝脏中的病毒滴度。 【结果】【结果】 两种不同给药方式注射 Adv-GFP 入小鼠体内后，在基因转录与 GFP 表达上 均显示 Adv-GFP 主要分布在肝、脾、肺和肾；腹膜后注射与尾静脉注射相比，肝组 织内腺病毒转录与表达明显增多（P0.05） ，而脾、肺和肾有不同程度的减弱；
3、腹膜 后注射的腺病毒亦会短时内进入体循环，但肝组织的病毒滴度在 1w 内的各个时间点 均明显高于尾静脉途径。 【结论】【结论】 重组腺病毒的腹膜后注射能够优化治疗效果，并在一定程度上减少全身反 应，更适于肝癌肝移植后的基因治疗。 【关键词】 ：【关键词】 ：腺病毒；体内分布；基因治疗 第二部分第二部分 新型溶瘤腺病毒经由静脉输注后的新型溶瘤腺病毒经由静脉输注后的 生物学分布和动力学生物学分布和动力学 【目的】【目的】 评价新型溶瘤腺病毒 M1 由静脉途径进入体内后的病毒分布、复制和代谢 清除动力学，以及 M1 单独使用的抗肿瘤效应。 【方法】方法】 建立具有高频转移特性的人胃癌裸鼠原位移植瘤动
4、物模型；观察各处理组 3 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 模型鼠的生存时间； 在指定时间点处死动物， 分离原发瘤及转移瘤进行病毒滴度测定； 采用免疫组化和原位杂交来检测病毒的分布和活性复制；采用 Western blot 检测 M1 的靶点封闭效应。 【结果】结果】 在人胃癌裸鼠原位模型上，M1 经静脉输注后不仅分布于胃原发瘤，而且存 在于转移灶；M1 在肿瘤细胞中活性复制导致肿瘤细胞坏死和靶基因 plk1 表达降低； 于成瘤早期（2w）静脉内给药可以延长荷瘤鼠的生存时间（P0.05） 。 【结论】【结论】 溶瘤腺病毒 M1 的静
5、脉内输注可以发挥溶瘤和靶向灭活 plk1 的双重效应， 因此其单独应用时能够在原发瘤和远处转移灶有效感染复制，最终清除肿瘤病灶。 【关键词】【关键词】溶瘤腺病毒；静脉输注；分布；动力学 第三部分第三部分 人脐静脉内皮细胞的分离培养及条件复制性腺病毒人脐静脉内皮细胞的分离培养及条件复制性腺病毒 对此细胞的作用研究对此细胞的作用研究 【目的】【目的】 本研究于体外分离培养人脐静脉内皮细胞，并以此为模型，探讨条件复制 性腺病毒对增生期和静止期的血管内皮细胞的生长影响。 【方法】【方法】 脐静脉内灌注消化液分离内皮细胞，所获内皮细胞体外培养，经免疫荧光 染色及扫描电镜检查，鉴定所获内皮细胞及其纯度；细
6、胞病变实验(CPE)检测条件复 制性腺病毒 Adv5/dE1A-Aschk1 的细胞裂解效应；四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测不同 滴度腺病毒对血管内皮细胞的生长抑制作用；流式细胞仪分析腺病毒单用或联合放射 线的细胞凋亡。 【结果】结果】 血管内灌注消化液法可获取高纯度的内皮细胞；血管内皮细胞与宫颈癌细 胞 HeLa 相比，对条件复制性腺病毒 Adv5/dE1A-Aschk1 较耐受，500MOI 的病毒滴度 感染静止态内皮细胞未出现明显的裂解效应；Adv5/dE1A-Aschk1 对内皮细胞的生长 抑制效应随病毒滴度的增加而增强，100MOI 的病毒作用 96 小时，增殖态内皮细胞生 长受抑（
7、22.02.5），而静止态内皮细胞为（13.02.3）；Adv5/dE1A-Aschk1 转 染联合放射线处理下，增殖态内皮细胞(凋亡细胞达 35.7 3.0)较静止态(23.1 2.5)更为敏感。 4 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 【结论】结论】 体外分离的人脐静脉内皮细胞可作为探讨条件复制性腺病毒效应的模型细 胞; 条件复制性腺病毒 Adv5/dE1A-Aschk1 损伤血管内皮细胞的病毒剂量高于杀伤肿 瘤细胞的有效剂量,有良好的治疗窗; 增殖态血管内皮与静止态相比，更易被复制性腺 病毒杀伤. 【关键词】【关键词】脐静脉；血
8、管内皮细胞；腺病毒；分离；培养 第四部分第四部分 新型溶瘤腺病毒新型溶瘤腺病毒 M1 体内应用的体内应用的 免疫安全性研究免疫安全性研究 【目的目的】 观察重组腺病毒载体 M1 经尾静脉注射和腹膜后注射及与免疫抑制疗法结 合体内应用时的免疫安全性。 【方法方法】 采取尾静脉注射和腹膜后注射纯化重组腺病毒 M1 建立动物模型, 连续给予 环孢素A 7 d, 取不同时间点小鼠肝组织和血清样本, HE染色观察肝脏病理反应, 免疫 组化方法检测肝组织腺病毒的表达情况；同时检测了肝脏局部淋巴细胞的募集情况和 腺病毒特异性的细胞免疫反应。 【结果结果】 实验小鼠一般情况好，无任何全身毒性表现，伴有轻微的一
9、过性 ALT 和 Cr 升高，常规病理检查仅发现肝组织轻微的炎症反应。腹膜后注射与尾静脉注射相比， 其病毒蛋白表达较尾静脉注射组为多。加用环孢素 A 能显著降低腺病毒导致的 ALT 和 Cr 升高；有效提升重组腺病毒在小鼠肝脏的浓度。 【结论结论】 新型复制选择性腺病毒 M1 体内应用是安全的，可与免疫抑制疗法相结合 提升其有效性和安全性。 【关键词关键词】 溶瘤腺病毒；体内应用；安全性 第五部分第五部分 新型溶瘤腺病毒靶向性改造的研究新型溶瘤腺病毒靶向性改造的研究 【目的目的】 探索将新型溶瘤腺病毒 M1 转染肿瘤抗原特异性 CTL 以达到有效清除肿瘤 原发灶及转移病灶的新方法。 【方法方法
10、】 构建 CARex-Tat 融合蛋白的真核表达系统，利用纯化的 CARex-Tat 融合蛋 5 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 白协助腺病毒 M1 转染体外分离诱导出的肿瘤抗原特异性 CTL。 【结果】【结果】体外分离诱导出肿瘤抗原特异性 CTL。构建 pcDNA-CARex-Tat 质粒并获得 融合蛋白。在上皮细胞的病毒感染效率检测中，CARex-Tat 融合蛋白可以提高腺病毒 允许细胞株 HeLa 的转染效率（P0.05） 。在悬浮细胞的病毒 感染效率检测中，CARex-Tat 融合蛋白可以提高 K562 细胞的腺病毒转染效
11、率，但不 能改善肿瘤抗原特异性 CTL 细胞的低转染效率。 【结论结论】 体外分离诱导肿瘤抗原特异性 CTL 是切实可行的，但利用 CARex-Tat 融合 蛋白的介导提高腺病毒转染 CTL 效率的方法需进一步改进。 【关键词关键词】溶瘤腺病毒；肿瘤抗原特异性 CTL；柯萨奇-腺病毒受体 6 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 Abstract Part Characterization of the kinetics of viral distribution and spread after different injection
12、 of adenovirus Adv-GFP in a BALB/c mice model Objective To explore the kinetics of viral distribution and spread in a BALB/c mice model after the intravenous infusion or retroperitoneal infusion, and evaluate the safety of reconstructed adenovirus administration with liver transplantation in hepatoc
13、ellular carcinoma therapies. Methods BALB/c mice were intravenously or retroperitoneally injected with purified Adv-GFP in order to make animal models. The expression of green fluorescence protein (GFP) and the adenovirus mRNA was determined using fluorescence assay and in situ hybridization. The vi
14、rus in serum and liver was tittered at the indicated time point. Results The expression of GFP and adenovirus mRNA were both located preferentially in liver, spleen, lung and kidney by two methods of infusion in mice. There were more adenovirus vectors in liver after the retroperitoneal infusion tha
15、n that after intravenous infusion. Though there was virus dissemination into the general circulation at early time points after retroperitoneal infusion, the amount of virus in liver was higher in 1w than that after intravenous infusion. Conclusion The retroperitoneal infusion of adenovirus vectors
16、may be achieve better treatment and reduce systemic reaction in a certain extent, which is more suitable for gene therapy. Key wards Adenovirus; Body distribution; Gene therapy Part Biodistribution and kinetics of novel selective oncolytic 7 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 adenovirus M1 via systemic administration Oncoly
