《传染性软化病病毒的超微病理学研究及其vp1基因的克隆和序列分析(1)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《传染性软化病病毒的超微病理学研究及其vp1基因的克隆和序列分析(1)（51页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、浙江大学动物科学学院 硕士学位论文 传染性软化病病毒的超微病理学研究及其VP1基因的克隆和序列 分析 姓名：苘娜娜 申请学位级别：硕士 专业：特种经济动物饲养 指导教师：鲁兴萌 20080501 摘要 传染性软化病病毒是养蚕生产上比较常见的一种疾病，它专一地侵染家蚕中 肠上皮组织，造成其中肠上皮细胞的超微结构发生病变。在染毒家蚕的中肠杯形 细胞内形成特异性小泡体和电子稠密体等特异性结构。电镜观察显示在感染早 期，微绒毛膜、线粒体附近、相邻两个细胞的细胞膜和内质网等较易发现胶体金 颗粒( 1 0r i m ) 的吸附。其后在微绒毛中间和细胞质中，以及内质网和特异性小 泡体的界限膜附近出现或较多存
2、在，但线粒体和特异性小泡体的内部未见金颗粒 的吸附。因此可以认为家蚕传染性软化病病毒主要在染毒细胞的各细胞器膜附近 出现。 以首株在中国分离到的家蚕传染性软化病病毒，B m I F V C H N 0 0 1 基因组为 模板，扩增了编码主要结构蛋白的V P l 基因。克隆测序后得到V P l 基因片段9 0 6 b p 。该序列与己发表的日本毒株相比，核苷酸序列的相似性为9 9 3 ，编码氨基 酸的相似性为1 0 0 ，证明该毒株和日本株的同源性较高。把B m I F V - C H N 0 0 1V P l 序列与同属的6 个昆虫小R N A 病毒结构蛋白进行了序列比对，构建了系统发育 树，
3、对其进化关系做初步的分析，结果显示这7 种病毒具有较近的亲缘关系。为 下一步的基因表达以及抗原表位的分析打下基础。 关键词：家蚕；传染性软化病病毒：超微结构；免疫电镜：V P l 基因片段； 克隆；序列分析 I 逝江太堂熊i ：生垃论奎 苴埋蛏：Q Q 墨 I n f e c t i o u s A B S T R A C T f l a c h e r i ed i s e a s eo fs i l k w o r m ，B o m b y xm o r ii sav i r a ld i s e a s ec a u s i n g s e r i o u sl o s so fs e
4、r i c u l t u r e B o m b y xm o r ii n f e c t i o u sf l a c h e r i ev i r u st a r g e t st h eg o b l e t c e l l si nm i d g u te p i t h e l i u mo fs i l k w o r me x c l u s i v e l y T h ev i r a li n v a s i o nr e s u l t e di nt h e p a t h o l o g i c a lc h a n g e so fc e l l u l a r
5、u l t r a s t r u c t u r ea n ds p e c i f i cv e s i c l e sa n de l e c t r o nd e n s e b o d i e s I m m u n o e l e c t r o nm a c r o g r a p hs h o w e dt h a tt h eg o l dp a r t i c l e s ( 10 珈 1 1 ) w e r e o b s e r v e df r e q u e n t l ya r o u n dt h em i c r o v i l l i ，m i t o c
6、h o n d r i a , m e m b r a n e sb e t w e e nc e l l s a n de n d o c y t o p l a s m i cr e t i c u l u ma tt h ee a r l ys t a g eo fi n f e c t i o n 。昕坊t h ei n f e c t i o n p r o g r e s s i o n ，m o r eo rl e s sg o l dp a r t i c l e sa p p e a r e di nm i c r o v i l l i ，c y t o p l a s m
7、a n d e n d o c y t o p l a s m i cr e t i c u l u ma n dt h em e m b r a n e so fs p e c i f i cv e s i c l e s ，b u tn og o l d p a r t i c l e sW a so b s e r v e di nt h ei n t e r i o ro ft h em i t o c h o n d r i aa n ds p e c i f i cv e s i c l e s I tW a s c o n c l u d e dt h a tB o m b wm
8、 o r ii n f e c t i o u sf l a c h e r i ev i r u sa p p e a r e dm a i n l ya r o u n dt h e m e m b r a n es t r u c t u r eo fc e l l u l a ro r g a n e l l e s B m l F V - C H N 0 01i St h ef i r S ts t r a i no fi n f e c t i o u sf l a c h e r i ev i r u si s o l a t e di nC h i H a S e q u e
9、n c eo fV P 1g e n ef r a g m e n t ，c o d i n gm a i ns t r u c t u r a lp r o t e i n ? f r o mI F V - C H N 0 01 W a sa m p l i f i e d S u b s e q u e n tc l o n i n ga n ds e q u e n c i n gs h o w e dt h es e q u e n c ef i a m a a e n t w a s9 0 6n u c l e o t i d e si nl e n g t h C o m p a
10、r i s o n 、析t ht h eV P1 g e n eo fp u b l i s h e dJ a p a n e s e s t r a i n ，n u c l e o t i d es e q u e n c e ss i m i l a r i t y W a s9 9 3 w h i l et h ea m i n oa c i ds e q u e n c e s s i m i l a r i t y W a su pt O10 0 t h a ti n d i c a t e dB m l F V - C H N 0 01w a sh i 曲h o m o l o
11、g o u st O J a p a n e s es t r a i n A m i n oa c i ds e q u e n c e sa i i g n m e mW a sp e r f o r m e db a s e do nt h em a i n s t r u c t u r a lp r o t e i n sf r o mB m I F V - C H N 0 01a n do t h e rs i xv i r u s e sb e l o n g e dt Ot h es a m e g e n u s ，i f l a v i r u s Ap h y l o g
12、 e n e t i ct r e eW a sc o n s t r u c t e d T h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e r e 一 w e r ec l o s er e l a t i o n s h i p sw i t ht h es e v e nv i r u s e s T h eg e n e se x p r e s s i o na n da n t i g e n I o c a l i z a t i o x aa r et h ef o l l o w i n gw o r k K e y w o r d l s
13、：B o m b y xm o r i ；i n f e c t i o u sf l a c h e r i ev i r u s ；u l t r a s r _ r u c t u r e ；i m m u n o e l e c t r o n l m i c r o s c o p y ；V P 1g e n ef r a m n e m ；c l o n i n g ；s e q u e n c i n ga n a l y s i s 3 第一部分文献综述 1 传染性软化病病毒( B m l F V ) 的研究进展 1 1B m l F V 的研究历史 家蚕的软化病是我国养蚕生产
14、上比较常见的一种传染性蚕病。很长一段时 期，国内外学者都认为软化病的病因是细菌感染和生理不适。1 9 2 6 年法国学者 P a i l l o t 最早提出是由软化病由病毒所引起( 吕鸿声，1 9 8 2 ) 。A y u z a w a ( 1 9 7 2 ) 应用C s C I 密度梯度超速离心技术得到了较纯的坂城株病毒，电子显微镜观察到 直径为2 6 + _ 2 n m ，呈正二十面体( 球状) 的病毒粒子，并将该病毒称为：家蚕传 染性软化病病毒( B o m b v xm o r ii n f e c t i o u sf l a c h e r i ev i r u s ，简称B
15、m I F V ) ( W a t a n a b e ， 1 9 7 6 ) 。 1 9 5 8 年在我国的江浙蚕区曾大量出现食桑减少，行动迟缓，体躯瘦小，渐 至完全停止取食，肠腔前端无桑叶，消化液变成红褐色，胸部呈半透明状的空头 性软化病蚕，用病蚕中肠的磨碎液经B e r k e f e l d 等细菌过滤器过滤以后，进行蚁蚕 添食的生物试验，确认在我国养蚕生产中存在着由非包涵体病毒引起的传染性蚕 病( 曹诒孙等，1 9 6 3 ) 。但在随后的研究中发现是由家蚕浓核病病毒( B o m b y xm o r i d e n s o n u c l e a r s i sv i r u s
16、 。B m D N v ) 引起的家蚕脓核病( 岩下嘉光和曹诒孙，1 9 8 3 ) 。 2 0 0 2 年，本研究室从浙江桐乡蚕区的疑似病蚕中分离到一株病毒，根据病征、磷 钨酸负染病毒形态观察、血清学、病毒核酸性质、荧光抗体组织病理学和R T - P C R 等结果确定为B m I F V ，命名为B m I F V - C H N 0 0 1 ( 陆奇能等，2 0 0 6 ) 。同时利用双 扩散试验对浙江部分蚕区疑似病蚕进行流行状态调查，发现疑似病蚕的感染检出 率约3 0 ( 朱宏杰，2 0 0 6 ) 。 1 2 B m I F V 的结构特征 B m l F V 的基因组为单股正链R N A ，病毒粒子呈二十面体结构( 图1 1 ) ，直 径2 6 n m ，沉降系数s ：k 为z a S ，相对分子质量为2 4 x 1 0 6 。R N A 占病毒粒子质 量的2 8 5 。电镜观察揭示B m l F V 基因组呈直线状( H ue ta 1 ，1 9 8 8 ) 。
