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1、华中科技大学 博士学位论文 湖北麦冬资源品质与不育机理研究 姓名：周群 申请学位级别：博士 专业：药理学 指导教师：陈家春 20090501 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 1 摘 要 湖北麦冬 Liriope spicata （Thunb.）Lour. var. prolifera Y. T. Ma 是中药“ 山麦冬” 的主要基原植物，药用其块根，具有养阴生津，润肺清心之功效，它是常用中药麦冬 的主流品种和湖北省的道地药材。湖北麦冬开花不结实，在种植生产中只能行无性繁 殖。由于长期无性繁殖，种质呈明显的退化趋势，严重影响其产量和质量。本文利用 本草学、植物形态学、细胞生物学、
2、植物胚胎学、生药学和分子生物学等多学科的方 法和技术对湖北麦冬的资源品质与不育机理进行研究，为优化种质及品种改良提供理 论依据和应用基础，对于提高湖北麦冬的产量和质量，提升湖北麦冬产业，具有重要 的理论和实际意义。主要的研究成果如下： 1 湖北麦冬的本草学、生药学及RAPD分子标记鉴定研究。 本草学考证结果表明，麦冬药用历史悠久，而宋代图经本草及重修政和经 史证类备用本草收载的“ 随州麦门冬” 似山麦冬(Liriope)属植物，其形态、产地与现 今药用的湖北麦冬基本一致。 对湖北襄樊GAP基地生产的湖北麦冬进行生药学研究，补充和完善了湖北麦冬的 品种鉴别标准。结果表明，湖北麦冬与其它麦冬来源植
3、物在形态学及细胞学上均存在 一定差异。可以通过花丝是否明显，花药锐头或钝头，子房的位置，地下走茎的有无， 花葶长度及花序在花后是否长叶簇或小苗等形态学特征将麦冬、湖北麦冬、山麦冬和 短葶山麦冬区别开来。根据块根横切面韧皮部束数目的多少易于区别麦冬和湖北麦 冬。 采用随机扩增多态DNA（RAPD）技术首次从 DNA 水平检测和分析了不同栽培 措施处理的湖北麦冬、山麦冬、恩施产麦冬、杭麦冬和川麦冬的亲缘关系和遗传多样 性，用SPSS软件对扩增片断的相关性进行聚类分析。从100个随机引物中筛选出10个 扩增条带清晰、稳定、重现性好和多态性明显的引物，10个引物共扩增出75个条带， 其中多态性条带58
4、个，占总扩增条带的77.3%。湖北麦冬不同栽培条件和组织培养植 株的相关系数均接近1。湖北麦冬与山麦冬的相关系数在0.740.88之间。麦冬（杭麦 冬和川麦冬）与湖北麦冬和与山麦冬之间的相关系数分别为0.410.66和0.480.69。杭 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 2 麦冬与川麦冬的相关系数为0.74。 不同的山麦冬样品相关系数均在0.8以上。 结果表明， 22种麦冬类药用植物之间的亲缘关系与形态分类结果基本一致，组织培养和栽培措施 对遗传关系影响不大。但产于不同地区（四川、杭州、湖北恩施）的麦冬间具有明显 的遗传差异。 2 湖北麦冬的传粉生物学及交配系统与其不育的关系研
5、究。 考察了湖北麦冬花的形态特征、花期、花粉与胚珠比、花粉活力、柱头可授性及 传粉媒介，结果表明湖北麦冬花期为 6 月下旬至 8 月中下旬，单花花期 1 d，0920 左右开花，1630 左右关闭。自然状态下不存在风媒花粉流，为虫媒传粉。单花花期 内柱头都具有过氧化氢酶活性，开花后 12 h为可授期。花粉计数为 25 7789 682， 花期内散播出的花粉没有活力。湖北麦冬花粉的畸形率为 95.55% （2 066 个） 。湖北麦 冬花粉与胚珠比 Np/No 为 4 2961 614，为专性异交(Obligate xenogamy)的交配系统。 结论：花粉畸形率高无活力且花粉数相对稀少，为湖北
6、麦冬不育的生殖生物学原因。 3 湖北麦冬染色体核型研究。 研 究 结 果 表 明 ， 湖 北 麦 冬 为 三 倍 体 植 物 ， 其 核 型 公 式 为 2n=3x=54= 30m+24sm(1SAT)，遗传进化上属 2B型。一般认为，三倍体具有自然不育性，提示湖 北麦冬“ 花而不实” 可能是其三倍体所致。湖北麦冬核型为首次报道。我们的研究结果 支持湖北麦冬不应为山麦冬的变种，而应为两个种的观点。另外，本研究推测三倍体 湖北麦冬的来源可能是二倍体与四倍体自然杂交后形成的。结论：染色体核型为三倍 体是湖北麦冬不育的细胞遗传学原因。 4 湖北麦冬花粉发育与小孢子母细胞减数分裂行为的观察。 采用石蜡
7、制片显微镜下观察湖北麦冬花药和花粉发育过程，常规压片显微镜下观 察小孢子母细胞减数分裂行为。湖北麦冬小孢子母细胞减数分裂过程中染色体异常行 为多表现为：中期出现单个染色体游离在纺锤体外面，在后期出现染色体桥和落后染 色体，在末期出现单个染色体游离在细胞核外形成微核的现象。花粉发育异常，产生 大量畸形花粉。花药绒毡层在减数分裂早期已大部分解体退化，绒毡层细胞液泡化膨 大，单核小孢子败育，花粉粒畸形。少数成熟花粉为 2- 细胞型。结论：减数分裂过程 中高频率的染色体异常行为是引起小孢子的败育，从而导致湖北麦冬不育的原因。这 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 3 些异常现象也支持湖北麦
8、冬为三倍体植物的观点。绒毡层发育异常和提前退化是湖北 麦冬花粉败育的重要原因。 5 采用湖北麦冬的花药为外植体离体培养再生植株。 以湖北麦冬花药为外植体，采用 MS 培养基，附加不同的植物激素进行实验。常 规压片通过显微镜进行再生植株染色体的计数分析。结果表明，MS+2，4- D 1.0 mg L- 1+KT 2.0 mg L- 1诱导胚性愈伤组织效果最好，愈伤组织诱导率可达 41.07%。 MS+6- BA 1.52.0 mg L- 1 +NAA 0.10.3 mg L- 1适于不定芽的诱导，不定芽转入附加 NAA 0.10.3 mg L- 1的 12 MS 的生根培养基上，生根后获得完整的
9、再生植株。再 生植株为体细胞起源。4低温预处理对湖北麦冬花药培养的影响不显著。湖北麦冬 种子和芽经该体系培养，愈伤组织诱导率高，并可获得再生植株。结论：本研究建立 了湖北麦冬花药培养体系和快速繁殖途径。为进一步采用细胞和基因工程技术改良湖 北麦冬奠定了良好基础。 关键词：湖北麦冬；传粉生物学；染色体核型；减数分裂；花药培养；不育机理； 生药学 华 中 科 技 大 学 博 士 学 位 论 文 4 Abstract Liriope spicata (Thunb.) Lour. var. prolifera Y. T. Ma is one main original plants of the tr
10、aditional Chinese materia medica “ Shanmaidong” . Its tuberous roots are used medicinally, with effects of nourishing Yin to promote the production of body fluid and moistening the lung to clear away heart- fire. L. spicata var. prolifera is one geoherb from Hubei province and the main variety of co
11、mmon traditional Chinese materia medica “ Maidong” . It has no seeds after efflorescence and reproduces only by vegetative propagation. Because of long- term vegetative propagation, its germplasm degenerated and production and quality were influenced severely. In this paper the resource- quality and
12、 the mechanism of sterility were studied by using the method of bencaology, plant morphology, cell biology, plant embryology, pharmacognosy and molecular biology. It provides available data and theoretical foundation for breeding. Our findings have important practical significance for increasing pro
13、duction and quality and raising industry of L. spicata var. prolifera. The results were as following. 1 Studies on bencaology, pharmacognosy and RAPD analysis of L. spicata var. prolifera. The research on bencaology indicated that Chinese materia medica “ Maidong” was used medicinally for long histo
14、ry. Suizhou Maidong was recorded in Classified Materia Medica for Emergency in Song Dynasty, which was similar with plants of the genus Liriope. Its shapes and place of produce were consistent with L. spicata var. prolifera. In order to provide the scientific evidence for identification and estimati
15、on, L. spicata var. prolifera from Xiangfan city, Hubei province was studied in pharmacognosy. The results show that there exists certain difference in morphology and cytology between L. spicata var. prolifera and other original plants of “ Maidong” . L. spicata var. prolifera, L. spicata, Ophiopogo
16、n japonicus and L. muscari Bailey can be distinguished by lengths of filaments of flowers, place of ovary, blunt- end or sharp- end anthers, lenth of scape and little buds after efflorescency. On the other hand, L. spicata var. prolifera and O. japonicus can be distinguished by the number of phloem bunch in cross sections of root tubers. To analyze the genetic relationships and diversi
