l亮氨酸的生产、应用及育种思路

《l亮氨酸的生产、应用及育种思路》由会员分享，可在线阅读，更多相关《l亮氨酸的生产、应用及育种思路（6页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、发酵工翟U 开舅，会 第十九坎年会材料 L 一亮氨酸的生产、应用及育种思路 山东省食品发酵工程重点实验室 刘建军赵祥颖田延军等 L 一亮氨酸，又称白氨酸，化学名为a 一氨基异己酸，1 8 1 9 年P r o u s t 首先从奶酪中分离 得到，后来B r a c o n n o t 从肌肉与羊毛的酸水解物中得到其结晶，并定名为亮氨酸。L 一亮氨酸 是常见十八种氨基酸中的一种，也是人体八种必需氨基酸之一，另外由于L 一亮氨酸和L 一异 亮氨酸、L - 撷氨酸的分子结构中都含有一个甲基侧链而被称为支链氨基酸( B r a n c h e dc h a i n a m i n aa c i d s

2、 ，B C A A ) 。 1L 一亮氨酸的分子结构及其物理化学性质 L 一亮氨酸分子式为C 6 H 1 3 0 2 N ，相对分子量1 3 1 1 8 ，结构式为： 刚3 丁HC 一3 O O H L 亮氨酸为白色结晶或结晶粉末，是一种非极性氨基酸，味微苦，溶于水，2 0 * ( 2 、2 5 0 ， 时溶解度分别为2 3 7 9 l L 和2 4 2 6 9 L ，乙酸( 1 0 9 9 l L ) 、稀盐酸、碱溶液及碳酸盐溶液，微 溶于醇( 0 7 2 9 l L ) ，不溶于醚，加热到1 4 5 人r1 4 8 ( 2 时升华，2 9 3 - 2 9 50 C 时分解，比重 i 2 9

3、 ( 1 8 0 C ) ，。比旋光度【a 】D 2 0 为+ 1 4 5 人一+ 1 6 0 ( 6 m o l LH c l ，C = 1 ) ，等电点5 9 8 。 2L - 亮氨酸的生产方法 一 7 氨基酸的制造是从1 8 2 0 年水解蛋白质开始的。1 9 0 8 年日本人I k e d a 发现谷氨酸钠是鲜 味的强化剂，开始了工业化生产氨基酸的历史。1 9 5 7 年日本开始运用微生物进行谷氨酸发酵 生产，从此揭开了微生物发酵方法生产氨基酸的历史新篇章。2 0 世纪六十年代左右，关于L 一 亮氨酸生物合成以及其代谢调节机制相继阐明。这为微生物发酵法生产L 一亮氨酸定向育种及 酶法生

4、产L 一亮氨酸提供了理论基础。 L 一亮氨酸的生产方法主要有提取法、化学合成法、酶催化法、微生物发酵法等。 2 1 蛋白质水解法 氨基酸是蛋白质的组成单位，在酸性条件下，将L 一亮氨酸含里较高的蛋白质水解，得到 各种氨基酸的混合物，经分离、纯化、精致等工序获得L 一亮氨酸产品。 。我国大部分厂家采用蛋白质水解法生产L 一亮氨酸。蛋白质水解法生产L 一亮氨酸的优点 是生产设备简单，技术要求不高，并且L 一亮氨酸在蛋白质中的含量较高。但是蛋白质水解法 生产的缺点是费时、污染严重、收率低、产品质量得不到保证，大规模生产受到限制。 2 2 化学合成法 亮氨酸化学合成法有A S t r e c k e

5、r , n 一卤代酸氨解、相转移催化等几种方法。虽然化学合 成法原理简单，价格低廉，但操作复杂，反应条件苛刻，副产物多，产率不高，并且有的方法 涉及到有毒物质。化学合成法得到亮氨酸是消旋的D L 亮氨酸，为了得到L 一亮氨酸，必须 进行光学异构体的拆分。因此化学合成法很少用于L 一亮氨酸的生产。 2 3 酶催化法 酶催化法生产L 一亮氨酸通常是利用转氨酶转氨给a 一酮基异己酸生成L 一亮氨酸将相 关的酶和N A D H 共价结合在膜上，让底物缓缓地经过膜而进行酶催化反应生成L 一亮氨酸。如 1 9 8 1 年，W i c h m a n ne ra 1 建立了一种用超滤膜制成的膜反应器，膜上共

6、价结合了亮氨酸转 氨酶、甲酸转氨酶、和N A D H ，当底物。一酮基异己酸通过膜反应器后，可被催化生成L 一亮 氨酸，其中N A D H 通过甲酸同步氧化成C 0 2 实现再生。 酶法生产氨基酸的优点是转化能力强，可避免代谢调控中的反馈抑制和反馈阻遏，并且其 生物反应器紧凑，产物组分相对单一，易进行后工序加工处理，可以提高产品质量，降低成本。 但酶法生产中所用到的酶需通过微生物发酵生成并提取精制，工艺过程比较复杂，且成本较高， 因此目前尚未得到广泛的应用。如果能够低成本获得高酶活的酶，则酶法生产L 一亮氨酸是一 条经济可行的工艺路线。 2 4 微生物发酵法 2 4 1 添加前体物发酵法 1

7、9 8 7 年德国学者G r o e g e r e 采用添加前体物。一酮基异己酸生产L 一亮氨酸，当培养基 中添加前体物。一酮基异己酸的浓度为2 0 9 L ，谷氨酸棒杆菌A T C C1 3 0 3 2 发酵5 7 h ，可生 成1 6 9 LL 一亮氨酸，质量转化率9 1 9 6 ；而采用分批流加培养法，可流加a 一酮基异己酸 3 2g L ，发酵2 3 h ，产L 一亮氨酸2 4g L ，从。一酮基异己酸到L 一亮氨酸的转化是经过转 氨酶的催化生成的。 2 4 2 直接发酵法 微生物直接发酵法生产L 一亮氨酸是最具潜力的方法，国内外都有不少的研究。主要的生 产菌株有：粘质赛氏杆菌( S

8、 e r r a t e am a r c e s c e n s ) 、乳糖发酵短杆 。 菌( B r e v i b a c e r i u ml a c t o f e r m e n t u m ) 、谷氨酸棒杆菌 ( C o r y n e b a c t e r i u m g l u t a m i c u m ) 、钝齿棒杆菌( C o r y n e b a c t e r i u mc r e n a t u m ) 、天津短 杆菌。( B r e v i b a c t e r i mT i a n j i n e s e ) 、黄色短杆菌( B r e v i b a

9、c t e r i u mf l a v u m ) 等。 微生物发酵法生产L 一亮氨酸最早见于1 9 6 7 年，C a l v o 报道的鼠伤寒沙门氏菌抗3 - 氟亮 氨酸突变株发酵液中能积累少量的L 一亮氨酸。1 9 7 3 年K i s u m i 选育的粘质赛氏杆菌( CS m a r c e s c e n s ) 突变株在1 0 的蔗糖培养基中发酵积累L 一亮氨酸1 0 1 3 9 L ：1 9 7 5 年， T s u c h i d a 将乳酸发酵短杆菌( B 1 a c t o f e r m e n t u m ) 2 2 5 5 诱变的菌株N o 2 1 8 ( 2 一

10、T A r ，I1 e 一) ，可在1 3 的葡萄糖培养基中积累亮氨酸2 8 9 L N o 2 1 8 菌株中已遗传性解除了L 一亮 氨酸对a 一异丙基苹果酸合成酶的反馈抑制和反馈阻遏；1 9 8 6 年T s u c h i d a 又报道了经亚硝基 肌诱变处理N o 2 1 8 ，筛选得到一株L 一亮氨酸高产菌，该菌株在1 3 的葡萄糖培养基中积累 能L 一亮氨酸3 4 9 L ，并遗传性解除了三种支链氨基酸对a - 7 , 酞经基酸合成酶的协同反馈阻遏i 国内有关L 一亮氨酸微生物发酵法生产最早见于1 9 7 9 年，张素珍等选育的钝齿棒状杆菌 ( C c r e n a t u m

11、) A S l 5 4 2 经亚硝基肌连续诱变得到突变株A S l 1 0 0 4 ，旋转式摇床上2 8 C 发酵9 6 小时，产L 一亮氨酸1 4 9 L ，在此基础上，1 9 8 9 年采用化学药物处理及快中子照射， 获得一高产突变株，产酸2 0 9 L 。宫锦萝利用亚硝基肌诱变处理黄色短杆菌，摇瓶发酵产酸达 1 3 5g L 。 1 9 9 3 年齐秀兰等报道，利用紫外线、利福平、氯化铿诱变黄色短杆菌的原生质 I 体，筛选得到L 一亮氨酸高产菌株，并对其进行发酵条件的优化，摇瓶产酸可达2 4 5g L 0 19 9 4 年刘党生筛选到一株a 一氨基P 一轻基戊酸和利福平抗性菌株，摇瓶产酸

12、可达32 I g l L 。 目前国内L 一亮氨酸的生产主要是从天然蛋白质水解液分离提取，而以微生物直接发酵法 生产L 一亮氨酸还处于小试研究。因此，选育优良的L 一亮氨酸生产菌株是实现发酵法工业生 产L 一亮氨酸的基础。 3L 一亮氨酸的代谢控制育种 L 一亮氨酸发酵是典型的代谢控制发酵，L 一亮氨酸的积累建立于对微生物中L - 亮氨酸合 成途径正常代谢调节的解除。也就是说，亮氨酸发酵的前提和关键在于是否能通过分子遗传学 方法和生物化学方法，在D N A 水平上改变和控制菌株的代谢，选育出解除与L 一亮氨酸有关 的调节机制的突变株，从而大量生成和积累L 一亮氨酸。 3 1L 一亮氨酸高产的基

13、本思路 。 氨基酸发酵属于典型的代谢控制发酵，代谢控制发酵的成败取决于微生物细胞自我调控机 制是否能够被解除和解除的效果。获得积累目的产物的突变株最有效的方法是通过基因突变解 除微生物的正常代谢控制。获得突变株常用的几种方法如下：选育营养缺陷型菌株，切断或改变 平行代谢途径：选育抗结构类似物突变株解除反馈抑制和阻遏i 选育细胞膜通透性突变株，使目 的产物分泌到细胞外，使细胞内终产物的浓度达不到引起反馈调节的浓度；应用基因工程、代谢 工程的手段有目的改造微生物菌株，使其高浓度合成目的产物。 对于L 一亮氨酸生产而言，( 1 ) 切断与L 一亮氨酸合成途径平行的相关支路，这样既能解除 支路终产物的

14、反馈调节，也能增加前体物向L 一亮氨酸支路的流量；( 2 ) 增加L 一亮氨酸前体物 磷酸烯醇式丙酮酸、丙酮酸和a 一酮基异戊酸、a 一酮基异己酸：( 3 ) 解除L 一亮氨酸对代谢途 径中关键酶的反馈调节，则菌株就不再受L 一亮氨酸正常反馈调节作用的影响，使终产物L 一 亮氨酸积累；( 4 ) 切断L 一亮氨酸向其它物质转化的途径，即菌株不能继续分解利用L 一亮氨 酸：( 5 ) 生成的L 一亮氨酸能及时地分泌到胞外。 3 2 选育L 一亮氨酸高产菌株的策略 根据L 一亮氨酸的生物合成途径、代谢调节机制及实现L 一亮氨酸积累的基本思路，定向 选育L 一亮氨酸高产菌的策略有：( 1 ) 选育L

15、 一蛋氨酸缺陷型( M e t - ) 和L 一异亮氨酸缺陷型( 1 l e 一) 磷酸烯醉式丙酮酸向L 一蛋氨酸、L 一异亮氨酸转化的这条支路就可减弱，而加大磷酸烯醇式 丙酮酸向L 一亮氨酸的另一前体物丙酮酸转化的代谢流；( 2 ) 选育丙氨酸缺陷型( A l a 一) ，丙酮酸 转化成丙氨酸的途径非常短，且可通过多种酶转化成丙氨酸，因此丙氨酸缺陷型的选育非常重 要，否则很大一部分丙酮酸流向了丙氨酸，进而影响最终L 一亮氨酸的积累；选育异亮氨酸营养 缺陷型菌株，仅仅解除了异亮氨酸对L 一亮氨酸合成途径中第一个关键酶乙酞乳酸合成酶的部 分反馈抑制和阻遏，但酶分子的结构和酶的合成调节没有改变，仍

16、然受L 一亮氨酸的反馈调节。 L 一亮氨酸的合成途径中第二个关键酶a 一异丙基苹果酸合成酶，同样受到L 一亮氨酸的反馈 抑制和阻遏。如果解除L 一亮氨酸对这两种关键酶反馈调节，菌体才有可能大量积累L 一亮氨 酸。筛选解除终产物的反馈调节最有效的方法就是选育抗结构类似物突变株( ( 3 ) 通过选育抗三 种支链氨基酸结构类似物的突变株来获得解除三种支链氨基酸对乙酞乳酸合成酶系反馈调节的 菌株。选育抗L 一亮氨酸结构类似物突变株，可获得解除L 一亮氨酸对a 一异丙基苹果酸合成 一 。 酶反馈抑制和对酶系反馈阻遏的突变株。因此可以推理出L 亮氨酸高产菌所可能带有的遗传 标记为L 一蛋氨酸缺陷( L M e t - ) ，L 一异亮氨酸缺陷( L n e - ) ，L 一丙氨酸缺陷( L - A l a - ) 、磺 胺胍抗性( S G r ) 、亮氨酸氧肪酸盐抗性( L e u H x r ) ，2 -