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1、华中科技大学 博士学位论文 KCNQ1通道突变致病机制及乙醇作用的研究 姓名：潘娜 申请学位级别：博士 专业：生物物理学 指导教师：丁久平 20090517 I 华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 摘 要摘 要 * * 离子通道是一种能够调节细胞膜两侧离子流的融合蛋白，它是神经、肌肉和其 它组织细胞膜兴奋的基础，也是生物电活动的基础。钾离子通道是迄今为止类型最 多的一类离子通道，它们广泛地分布于骨骼肌、神经、心脏、血管、气管、胃肠道、 血液、内分泌和腺体等细胞。KCNQ 基因编码的钾离子通道家族是电压门控钾离子 通道的一个重要分支，在心脏中大量
2、表达，在内耳也有分布。KCNQ1 及其辅助亚基 minK 形成的 KCNQ1/minK 复合体能够产生延迟外向整流钾电流 IKS，该电流帮助终 结心肌细胞中的动作电位，KCNQ1 基因若发生突变，就会引起该通道的功能紊乱， 从而引起心脏长 QT 综合征，即 LQTS，最终导致严重的心律不齐，室颤甚至心脏休 克。目前发现许多疾病与 KCNQ 基因突变或其编码的钾离子通道功能失调有关，鉴 于这些原因，弄清楚 KCNQ1 通道的相关特性，无论对于离子通道学，还是临床医 学都会具有很大的贡献。 本文在 HEK293 细胞上研究了 KCNQ1 突变基因 L191P 导致 LQT1 的机制。在 KCNQ1
3、 基因中有超过 100 种突变是引发 1 型 LQTS（LQT1）的主要原因，有报道 发现， 位于191位点的亮氨酸突变L191P能够直接引发LQT1， 该突变点位于KCNQ1 基因的 S2-S3 连接区域，大约有 16的 LQTS 突变点位于该区域中。在电生理实验 结果中，我们发现 L191P/minK 产生的电流远远小于正常的 WT/minK 的电流，电流 -电压（IV）曲线中显示 L191P/minK 的电流减少到 WT/minK 的电流的一半以下，但 是电导-电压（GV）曲线中显示没有明显的变化。在免疫荧光成像结果中，我们却发 现 L191P 使得正常的 KCNQ1 蛋白上膜量大大降低
4、，因此推断该突变通道因上膜量 剧烈变化使得心肌钾电流 IKs大大减小，从而影响动作电位复极化，导致 LQTS 的产 生。 为了更进一步了解这种上膜量的变化原因，我们将这个点的氨基酸残基 Leu 突 变成疏水性不同的氨基酸（Phe Leu Val Trp Ala Pro Lys Asp） ，发现这 * 本研究课题得到国家自然科学基金（30770522）资助 II 华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 些突变随着其疏水性的减弱，其上膜能力也逐渐减弱。通过建立 E?M 模型，我们归 纳出这一规律遵循的波尔兹曼公式，应用于因能量变化而改变膜蛋白上膜效率的
5、情 况。同时，通过建立二项式分布模型，我们解释了 dominant-negative 效应的存在是 LQT1 表型存在的本质。 本文还在非洲爪蟾 Xenopus laevis 卵母细胞上研究了乙醇 （酒精） 阻断 KCNQ1 通道的机制。乙醇对人体具有广泛的药理学影响，研究者们知道乙醇对脑、心脏和 肝脏等的功能会产生不良影响，但不了解它起作用的机制。我们通过双电极电压钳 检测，结果表明乙醇能够特异性阻断 IKs电流，与其类似的其它直链烷醇亦能够阻断 该通道，而且烷醇链长越长，相同浓度下阻断能力越强。这种阻断效果不仅具有电 压依赖性，还同时兼具关闭态阻断和开放态阻断的特点，说明酒精阻断 KCNQ
6、1 通 道的作用位点可能既存在于细胞外，也存在于细胞内。通过突变扫描比对，我们还 发现 KCNQ1 上氨基酸 Ile257 在酒精等烷醇对 KCNQ1 通道的阻断过程中起着重要 的作用。 我们还借助 MedLab 生物信号采集处理系统，连续测量注射不同浓度乙醇的小 鼠心电图，结果表明一定浓度下乙醇（较低或者很高浓度）能够阻断心肌钾离子通 道，从而延迟动作电位的复极化，进而延缓心率；而某一特定浓度下的乙醇（较高 安全浓度）能够刺激心肌钾离子通道的开放，从而加速动作电位的复极化，进而加 速心率。我们利用了“口袋”模型进一步阐明烷醇和 KCNQ1 通道相互作用机制， 这对以 KCNQ1 通道为靶点的
7、药物研究有着重要意义。 关键词：关键词：离子通道 KCNQ 家族 双电极电压钳 免疫荧光 共聚焦显微 长 QT 综合征 dominant-negative 膜转运 III 华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 Abstract* Ion channel, a fusion protein regulating transmembrane ion flux, is the basis of bio-electrical activity and the membrane excitablity of nerve, muscle and other
8、tissu. Potassium channels are the most various ion channels, and widely exist in skeletal muscle, nerve, heart, vessels, trachea, gastrointestinal tract, blood and endocrine gland cells. KCNQ1 channel, which is an important branch of voltage-gated potassium channels, has a large distribution in the
9、heart, as well as the inner ear. Combined with its auxiliary subunit minK, KCNQ1/minK complex can generate a delayed outward rectifier K+ current, IKS, to end the action potential in myocardial cells, therefore, KCNQ1 mutations would cause a dysfunction of the channel, thus give rise to the long QT
10、syndrome (LQTS), eventually lead to serious arrhythmias, ventricular fibrillation and cardiac shock. Mutations in KCNQ gene can lead to many diseases, thus, it is very contributing to clarify the characteristics of KCNQ1 channels, both for the ion channel research and clinical medicine. We studied t
11、he mechanism of LQT1 arising from one KCNQ1 mutation, L191P, in HEK293 cells. Over 100 KCNQ1 mutantions can lead to the type-1 LQTS (LQT1). It is reported that KCNQ1-Leu191, which locates in the intracellular S2S3 linker of KCNQ1, can lead to LQT1 directly, and 16% LQTS-related mutations mustered in
12、 this region. By electrophysiological method, we found the currents of L191P/minK channel were much smaller than those of KCNQ1/minK channels. Although the average currents of L191P/minK were reduced to more than half compared with those of WT/minK, but there was no shift in the GV curves. By immuno
13、fluorescence method, we also found L191P channels causing a trafficking deficiency, leading to the minishing of IKs and then, LQTS. We found the surface expression decreased with decreasing hydrophobicity of * This work was supported by grants from National Science Foundation of China (30770522). IV
14、 华华 中 科中 科 技技 大 学 博 士 学 位 论大 学 博 士 学 位 论 文文 the middle residue X of the RXR motif. Establishing a model of E?M, we generalize the Boltzmann formula to explain the results, and we got the essence of LQT1 phenotype through the binomial distribution model, that is the dominant-negative effect. We also
15、studied the blocking mechanism of ethanol (alcohol) on KCNQ1 in Xenopus laevis oocytes. Ethanol has a wide range of pharmacological effects on the human body, but researchers do not understand the mechanism it works. Using two-electrode voltage clamp, we showed that ethanol blocked specificly IKs, e
16、ven the straight-chain n-alcohol also blocked the channel. The chain length was longer, the same concentration blocked stronger. The voltage-dependent and bio-states blocking showed us that ethanol blocked the channel both from outside and inside. Through mutation scanning, we also found that amino acid Ile257 of KCNQ1 played an important role in the
