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1、栝楼毛状根的生长与营养消耗动态研究 郭志刚，刁劲羽，刘瑞芝，陈奎发 清华大学化工系北京1 0 0 0 8 4 摘要：在批式培养情况下，栝楼毛状根的生长过程可m 分为四十生长阶段，即生长迟滞期，缓慢 生长期、快速生长期和衰亡期在迟浠期，培养液中的蔗糖、氙、磷、钾首先被陡速被吸收下降 然后再有所回升：在缓慢生长期，培养液中的葡萄糖、果糖、氙，磷和钾的浓度开始降低；到了快 速生长期，培养液中的碳溽、氮，磷、钾等营养物质被快速消耗，到了衰亡期，以上的营养物质基 奉被消耗待尽钙离子的消耗情况与咀上物质有所不同，从接种开始缓慢下降，当毛状根进八衰亡 期以后，由于老化细胞的损伤而有部分钙离子外泻与此同时，栝
2、楼毛状根的蛋白质也开始快速分 泌 关| 嚏词：栝楼、毛状根、蛋白质、分泌、动力学 在栝楼的根系中含有多种蛋白质其中分子量为2 7 2 9 k d 的核酸抑制蛋白具有较强的抗爱滋 病病毒感染的活性。因此，科学家利用农杆菌感染栝楼的植株或组织，诱导出毛状根。并利用其 大规模培养，生产这些核酸抑制蛋白。关于栝楼毛状根的培养条件以及促进核酸抑制蛋白合成的 条件，我们已经作过大量的研究，并且找到了基本培养条件。【l “3 但是为了促使栝楼毛状根更 加快速地生长，并且能够合成更多的核酸抑制蛋白，就必须充分了解栝楼毛状根的生长规律、蛋 白质合成规律以及其营养物质的消耗规律。这是实现培养过程控制和栝楼毛状根工
3、业化生产的必 由之路。 根据以往的实验结果表明，栝楼毛状根的生长和蛋白质的合成与分泌成反比1 也就是说， 毛状根在高速生长过程中会抑制蛋白质的合成和分泌，因此我们将毛状根的培养过程分为两个 培养阶段，即生物量积累阶段和蛋白质分泌阶段。首先给予适合于毛状根生长的培养条件，待获 得一定的生物量以后，再改变其培养条件，以促进其蛋白质的台成和分泌。本文重点报告栝楼毛 状根在快速生长阶段对于各种营养物质的需求量或营养消耗情况，为进一步促进毛状根的生长和 提高其蛋白质含量寻找理论参数。 1 材料与方法 我们选用了本研究室利用农杆菌L B A 9 4 0 2 转化诱导出的毛状根系，取继代培养过程中的括 楼毛
4、状根，选择带有茎尖的3 , - 4 c m 长先端部，接种在含有2 葡萄糖的M u r a s h i g e8 tS k o o g 培养 液中，培养液的p H 调整到5 6 5 8 ，培养温度为2 5 C ，暗培养。摇瓶机转速为9 0 r p m 。培养瓶的 体积为3 0 0 m 1 添加培养液体积为1 0 0 m l ，毛状根的接种量为2 9 ，重复处理三次。每隔3 日测 定一次毛状根的生长量，并且取样测定培养液中各种营养物质的消耗量和蛋白质的分泌量，2 1 日后作出生长曲线、蛋白质分泌曲线和营养物质消耗曲线。 营养物质的分析方法：采用了3 , 5 二硝基水杨酸显色剂法测定蔗糖的浓度：利
5、用血糖试剂 盒检测葡萄糖浓度：利用甲醛法测定氨态氮含量；利用酚二磺酸比色法检测硝态氨含量：利用磷 铝蓝比色法测定磷的含量；利用四硼酸钠比浊法检测钾的含量：利用E D T A 滴定法检测钙离子的 含量：利用考马斯亮蓝法测蛋白质含量。 2 结果与讨论 栝楼毛状根的生长过程与微生物或其他植物细胞培养比较相似既可以分为四个生长 阶段既生长迟滞期、缓慢生长期、快速生长期和衰亡期从图l 可以看到，从接种到第 6 1 4 9 天为迟滞期，在此期间毛状根的比生长速率迅速下降，毛状根的生长量也呈减少趋势。 这可能是毛状根从继代培养末期，突然转移到新的培养液中时，由于其中的物质含量和渗 透压变化太大，从而影响了毛
6、状根的正常生长。而为什么接种后前3 天的毛状根的比生长 速率较高这可能是由于接种毛状根根尖以后还保留着继代培养过程中的高速生长状态。 这也是植物适应新环境过程中经常遇到的反应滞后现象。 从第9 天到第1 2 天为缓慢生长期，在此期 间，毛状根开始缓慢生长，其比生长速率也开 始提高。这表明毛状根已经适应新的高渗透压 环境。从第1 2 天到第1 8 天为毛状根的快速生 长期，6 天内毛状根从2 0 9 增殖到9 0 9 左右。 其比生长速率也选到峰值。第1 8 天以后，毛状 根进入衰亡期毛状根的总量虽然还在继续积 累，但是其比生长速率已经开始下降。这可 能是由于此时的营养物质已经消耗怠尽的原 F
7、i g 1g r o w t h C t l l V eo f h a i r y r o o t so f 因a T r i c h o s a n t h e s i sk i r i l o w i io i l t h e g r o w t hs r a g e 图2 表示了毛状根在生长过程中的蔗糖消 耗情况。在毛状根的迟滞期虽然生长量不大， 但是作为碳源的蔗糖浓度却快速下降与此同时，培养液中的葡萄糖浓度开始上升。这说 明毛状根在生长初期，首先要合成各种酶以便将蔗糖代谢成葡萄糖和果糖除了满足其自 身生长的碳源需求以外多余的葡萄糖或果糖就会被扩散到培养液中。这种现象与辣根毛 状根的蔗糖
8、消耗情况基本相同。n 】从培养液的碳源变化来看，其中的蔗糖浓度不断降低， 而葡萄糖和果糖的含量却有所增加。在缓慢生长期，伴随着毛状根代谢能力的增强，对于 碳源的需求量也逐渐增加，从培养液中碳源的分析情况来看，蔗糖含量继续呈下降趋势 葡萄糖和果糖的含量还在继续增加，这说明伴髓着毛状根的缓慢生长，对蔗糖的代谢功能 也随之增强，由于此时毛状根生物量的关系，还不能快速将代谢成的蔗糖和果糖全部利用， 所以有更多的单糖被扩散到培养液中。在快速生长期，伴随着毛状根的快速生长，对于碳 源的需求量也迅速增加，从培养液中成分分析来看，蔗糖、葡萄糖和果糖的含量快速下降。 如果在此阶段给毛状根流加碳源，就能够促进毛状
9、根更加快速地生长。在衰亡期，毛状根 的比生长速率快速下降，此时培养液中的各种碳源已经被消耗殆尽，在第1 8 天几乎检测 F i g 2d e p l e t i o nC U n ，eo f c a r b o no n t h e 酎O 州hs t a g e 不到碳源的存在。栝接毛状根的这种碳源消耗规 律与丝瓜的毛状根非常相似。 图3 表示了栝楼毛状根对总氮和磷的消耗情 况，可以清楚地看到，毛状根对于总氮和磷的需求 趋势与碳源非常相似。既在迟滞期，氮和磷首先被 快速吸收，然后又被释放。这可能是由于在继代培 养后期，毛状根已经处于极度饥饿状态，当其被转 移到新的培养液中以后，必将通过主动吸收
10、和扩散 等途径快速吸收，但是，由于此时毛状根的生物量 不足，总的代谢水平不高所以一些未披完全代谢 的氮源和磷源就会被释放出来，特别是硝态氮被吸 收以后，应该在毛状根体内转化成氨态氮才能够参 芒-一l- 3ji=ilu 与氨基酸等代谢产物的合成但是，如果氨态氮在细胞内积累量过多，会给细胞自身造成伤害， 因此，其中的一部分就被释放到培养液中。到了缓慢生长期，伴随着毛状根的生长，这种释放过 程基本结束这表明毛状根已经适应该培养条件，并开始加快对氮素和磷的代谢。到了毛状根的 快速生长期可以明显看到培养液中的氮素和磷被快速吸收消耗这种现象非常符台植物生长发 育与营养消耗的规律。 F i g 3d e p
11、 i c t i o nc u r v eo f n i ”o g e na n d p h o s o h o z u so nt h eg r o w t hs n 2 e 三 童 量 03691 21 5L 82 t i a r a ( d a y ) F i g 4d e p l e t i o n C l X t co f k a l i u mO l it h eg r o w t hs t a g e 钾离子的消耗情况与氮素和磷基本相似( 图4 ) ，在迟滞期同样有一个被吸收高峰和被释放 的现象。在缓慢生长期，培养液中的钾离子被快速消耗，这说明伴随着毛状根的生长，对于钾离 子的吸
12、收能力也迅速增强。在快速生长期，钾离子被继续吸收利用但是其减少趋势有所缓解。 这可能与植物代谢反应滞后有关。 钙离子的消耗情况与上述营养物质的消耗模式有所不同它没有被快速吸收和释放的过程 ( 图5 ) 。从迟滞期到快速生长期，培养液中的该离子含量基本上星均匀下降趋势。这表明毛状根 即使在饥饿状态，也不能通过扩散的方式吸收钙离子。在衰亡期，有少量的钙离子被释放到培养 液中。这可能是由于毛状根在进入衰亡期之前，培养液中的碳源、氮源和磷已经被消耗殆尽，为 了维持毛状根生长点的继续伸长，一些成熟或老化的毛状根会自我牺牲，也就是将碳水化合物和 氮素等营养物质运送到生长点部位，而那些老化细胞就会园营养不足
13、而发生自溶，所以会有少量 的钙离子被释放到培养液中。 F 塘5d e p l 出o nc u r v o o f c a l c i u mo n t h e g r o w t hs t a g eF i g 6s c c r c f i o nc u r V eo f p r o z e i n O T I t h eg r o w t hs t a g e 蛋白质在培养液中的分泌情况与毛状根的生长具有密切的相关性。从图6 可以看到， 在迟滞期只有少量的蛋白质分泌出来，在缓慢生长期，蛋白质的分泌量有所提高但是， 到了快速生长期蛋白质的分泌量曾一度减少这可能是由于毛状根的快速生长不但抑 6
14、1 6 啪彻啪舌|瑚m瑚。 制了蛋白质分泌而且还将已经分泌到培养液中的蛋白质重新分解利用。到了衰亡期，由 于营养物质不足，毛状根的表皮细胞膜遭到破坏并开始变色，所以有更多的蛋白质披分泌 到培养液中。 以上实验结果真实地反映了栝楼毛状根在生长过程中，对于营养物质吸收和利用的动态变 化情况，让我们更加深入地了解了毛状根的生长与营养物质消耗之间的关系。与此同时也了解 了栝楼毛状根的蛋白质分泌特性。为栝楼毛状根的大规模培养过程控制以及有用蛋白质生产提供 了必要的理论参数。 参考文献 I ) 郭志刚白桂雨张荫精，栝楼毛状根培养与天花粉蛋白合成的研究，天然产物研究与开发2 0 0 0 ，1 2 ( 2 )
15、 ： 8 1 2 2 ) 郭志刚，白桂雨张荫群，生长调节物质对栝楼毛状根生长和天花粉蛋白合成的影响，生物技 术，2 0 0 0 ，1 0 ( 3 ) ：i 1 1 8 3 ) 郭志刚，刁劲羽，栝楼毛状根蛋白质分泌特性的研究一培养条件的影响，第八届全国生物化工学术会议论文 集，1 9 9 8 ，5 9 9 - 6 0 3 4 ) N a k a s h i m a d aY U o z u m iNa n dK o b a y a s h iT E f f i c i e n tc u l t u r e m e t h o d f o r p r o d u c t i o no f p l
16、a n t l a t s f r o m m e c h a n i c a l l y c u tH o r s e r a d i s hh a i r yr o o b J o u r n a lo f F e r m e m a t i o ua n dB i o e s l g i r t e e r i u g ，1 9 9 6 , 8 1 ：8 7 8 9 5 ) T o p p iLS ，G o r i n iP ，P r o p e r z ia ta l t P r o d u c t i o no f r i b o s o m e - i n a c t i v a t i n gp r o t e i nf r o mh a i r yr o o tc u l t u r e so f L u f f a c y l i n d r i c a ( L ) R o e m P
