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1、四个阶段：一、以导致遗传病的基因突变位点为靶标，以DNA分子杂交为核心二、以PCR技术为核心三、以生物芯片为核心四、以DNA测序技术为核心广义：分子标志物包括基因组DNA、各种RNA、蛋白质和各种代谢物临床分子生物学检验靶标主要以核酸（DNA和RNA）为主基因组DNA是临床分子生物学检验中最常用的分子靶标病原生物基因1.菌种鉴定：PCR-测序和PCR-DNA探针杂交;缩短检测时间 2.确定病毒感染和病毒载量：明确感染源，判断病情，监测疗效3.病毒分析：基因型变异产生不同临床症状4.细菌耐药监测和分子流行病学调查 ：随机扩增多态性DNA；指导选择治疗方案，控制病原菌的感染传播基因变异1.致病基因
2、的分子缺陷 2.线粒体基因突 3.肿瘤相关基因 单基因病1.致病基因结构发生了改变，影响了编码产物量和质的改变，如血红蛋白病、血友病、Duchenne肌营养不良等。2.致病基因中核苷酸三联体重复序列发生高度扩展，如脆性X综合征、亨廷顿病、强直性肌营养不良等。 基因多态性用于：1.基因定位和疾病相关性分析2.疾病诊断和遗传咨询3.多基因病的研究4.器官移植配型和个体识别循环游离核酸检测（包括游离DNA和游离RNA）用于：产前诊断、恶性肿瘤早期诊断、病例检测临床分子生物学检验技术以分子杂交技术、PCR技术和DNA测序技术、芯片技术、双向电泳技术、生物信息学技术为主要技术分子生物学检验技术可用于微生
3、物感染的确诊、感染性病原体的分型、耐药监测。分子生物学检验技术有利于临床上对遗传性疾病的早期预防、早期诊断、早期治疗。重要国际生物信息中心：1.美国国立生物技术信息中心（NCBI）2.欧洲生物信息学研究所(EBI) 3.日本国立遗传研究所（DDBJ）一级核酸数据库有GenBank、EMBL和DDBJ；蛋白质序列数据库有SWISS-PROT、PIR、UNIPROT等。蛋白质X射线晶体三维结构数据库有PDB等。蛋白质数据库常用的有SWISS-PROT、 PIR、 PDB数据库。二级数据库非常多，如人类基因组图谱库GDB、转录因子和结合位点库TRANSFAC、蛋白质结构家族库SCOP等。*乙型肝炎病
4、毒核酸的检测常用技术：1.普通PCR技术2.荧光定量PCR技术3. 支链DNA技术4. 核酸杂交技术5.杂交捕获系统6.基因芯片技术*HBV基因分型的方法： 1,PCR-RFLP 2.PCR-RBD 3.ELISA 4.基因芯片人乳头瘤病毒基因组结构 ： HPV DNA 为一双链闭环分子，基因组可分三个区段：早期区（E）、晚期区（L）、长控制区或上游调节区或非编码区。*HPV DNA检测及基因分型： 1.核酸杂交技术（主要包括核酸印迹、原位杂交、杂交捕获等技术。目前常采用HC 技术、核酸分子杂交与PCR相结合的方法。具有较强的特异性，并可分型） 2.PCR技术* （采用型特异性引物进行HPV快
5、速分型，现已成为HPV感染最常用的检测方法之一。目前常用通用引物-PCR（GP-PCR）和实时定量PCR。1. GP-PCR，依据不同HPV亚型有共同保守序列的特点来设计通用引物，可广谱扩增HPV DNA，具有较高的敏感性，可检测出10-400拷贝的HPV病毒含量。在GP-PCR的基础上，建立了巢式PCR和巢式多重PCR检测HPVDNA。提高了检测敏感性和多重感染率。2.实时定量PCR法，该法可实现HPV DNA定量和快速检测。 现在市售产品可以检测E6和E7的mRNA；进行HPV16、18、31、33与45分型。检测灵敏度高，但设备昂贵，操作繁琐，不适于宫颈癌的大规模筛查。） 3.基因芯片技
6、术（基因芯片可对HPV进行分型和多重感染诊断，适于高通量HPV筛查 ）4.流式荧光液芯技术 5.飞行时间质谱技术 临床意义：（一）宫颈疾病风险预测（二）疗效评估及术后跟踪（三）预防控制和疫苗研发*HIV-1基因组中，gag、pol、env为结构基因，编码病毒核心蛋白(gag)、多聚酶(pol)、和外膜蛋白(env)。vpr、rev、vif、tat、vpuvpx、nef等6个基因为调控基因，编码调控蛋白和辅助蛋白。核酸序列依赖扩增（NASBA）是一种等温扩增RNA的技术， 能直接扩增单链RNA特异序列，通过合成cDNA，在等温条件下进行体外序列特异性核酸扩增。NASBA需要AMV逆转录酶、核糖核
7、酸酶H、噬菌体T7RNA聚合酶共同作用完成。NASBA分非循环相(模板RNA 与引物互补)和循环相(转录的反义RNA 与引物 互补)两个阶段流行性感冒病毒核酸检测：主要有RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、基因芯片、逆转录-环介导等温扩增（RT-LAMP）等。结核分枝杆菌核酸的检测: 1.PCR 2.Real-time PCR 3. PCR-RFLP 4. 线性探针杂交法（LPA） 5.链替代扩增技术（SDA） 6.扩增结核分枝杆菌直接试验（AMTDT） 7.基因芯片技术 8.GeneXpert全自动结合检测平台结核分枝杆菌的耐药性检测:（1）DNA测序 （2）PCR-SSCP （3）PC
8、R-RFLP （4）PCR-RDB （5）基因芯片技术 淋病奈瑟菌核酸的检测: 1.PCR 2.实时荧光定量 PCR技术 3. 连接酶链反应 4.连替代扩增技术（SDA） 淋病奈瑟菌的主要耐药基因:（1）gyrA和parC基因 （2）pen A、ponA基因 （3）porB基因 （4）Mtr系统调控基因 （5）erm基因 淋病奈瑟菌耐药检测的分子生物学技术: （1）DNA测序 （2）PCR-SSCP （3）PCR-RFLP （4）基因芯片技术 *医院细菌感染的常用分子生物学检验技术: 1.脉冲场凝胶电泳(PFGE）被认为是菌株分子分型的“金标准” 2. PCR-RFLP 3.扩增限制性片段长度
9、多态性分析 (AFLP) 4. 重复序列PCR 5. 随机扩增多态性DNA技术 6. 多位点测序分型 白假丝酵母菌的分子生物学检验： 1.PCR 普通PCR、实时PCR、巢式PCR和多重PCR等 2. PCR-斑点杂交 3. DNA指纹技术，包括RFLP、随即扩增多态性分析（RADP）、电泳核型分析等 4. AP-PCR 5.DNA序列分析 6.基因芯片技术 新型隐球菌的分子生物学检验：1.PCR 2. 斑点杂交 3. PCR-RFLP 沙眼衣原体的分子生物学检验：1.PCR 2. 连接酶链反应 3. DNA序列分析 肺炎衣原体的分子生物学检验：PCR、实时荧光定量PCR技术、巢式PCR和竞争
10、性PCR肺炎支原体的分子生物学检验：1.PCR 2. 核酸杂交，探针有特异性DNA片段探针、人工合成的寡核苷酸探针、全DNA探针。常用斑点杂交。3. PCR-RFLP 梅毒螺旋体的分子生物学检验：1.PCR 2. 核酸杂交 3. PCR-RFLP 分子生物学检验可早期诊断患者的梅毒感染，及时治疗，防止病情恶化与蔓延。另外是耐药基因分析和流行病学研究的首选方法。弓形虫DNA主要有三种形式：染色体DNA、线粒体DNA、和胞质DNA 利用分子生物学技术已检出弓形虫的主要基因有B1基因、P22基因（SAG2）、P30基因（SAG1）、 P43（SAG3）和棒状体蛋白1（ROP1）等。 分生检测：1.P
11、CR 主要侧重检测B1基因和P30基因。 2. 斑点杂交 珠蛋白合成障碍性贫血的分子生物学检验 1.PCR 2.Southern印迹杂交 3.AS-PCR 4. SSCP 5.gap-PCR 珠蛋白生成障碍性贫血的分子生物学检验：PCR-RDB、PCR-RFLP、基因芯片、PCR-ASO、AS-PCR血友病B的分子生物学检验： 直接检测法有Southern印迹杂交、DNA测序、基因芯片和毛细管电泳； 间接检测方法有RFLP、SSCP、变性梯度凝胶电泳(DGGE) 、双脱氧指纹图谱、变性高效液相色谱（DHPLC）。 脆性X综合征的分子生物学检验： （一）Southern印迹杂交 （二）PCR （
12、三）微卫星序列分析 通过分子诊断FMR-1基因突变开展患者判定、携带者筛查、产前诊断和群体筛查等。 肿瘤相关的基因: 原癌基因、抑癌基因、细胞周期调节基因、细胞凋亡基因以及维持细胞基因组稳定性基因等。细胞周期调节基因: 周期蛋白（cyclins）、周期蛋白依赖性激酶（CDKs）、CDK抑制因子（CKIs）及细胞周期检查点等其他蛋白细胞凋亡相关基因可分三类：促细胞凋亡基因、抑制细胞凋亡基因、细胞凋亡过程中表达的基因。 p53是研究的较为充分的与肿瘤发生、发展关系明确的抑癌基因，绝大多数肿瘤都伴有p53基因的突变。乳腺癌（17号染色体长臂上）的发生、发展紧密联系的基因有BRCA1、BRCA2、TP
13、53、c-erbB2、c-Myc、P53、Bcl-2、BAX、iASPP、ATM、MDM-2以及PTEN等乳腺癌的分子生物学检验： 1.雌激素受体（ER）和孕激素受体（PR）检测（免疫组织化学） 2.c-erbB-2/HER2检测 （免疫组化、荧光原位杂交） 3. PS2检测 4. Ki67检测 5. 乳腺癌复发基因检测 （DNA微集阵列技术、多基因RT-PCR定量检测技术）（70基因检测方法、21基因检测方法）遗传性结直肠癌相关基因：结肠腺瘤性息肉病（APC）基因 、DNA错配修复（MMR）基因、微卫星异常微卫星异常主要表现为：微卫星不稳定性（MSI）；微卫星杂合性丢失（LOH）。结直肠癌的分子生物学检验：1.HNPCC的筛查2. 微卫星异常检测3. APC基因突变检测4. DCC基因突变检测5. DNA甲基化的检测6. 结直肠癌个体化治疗的相关检测 白血病相关基因突变 ：C-KIT、FLT3、 NPM（核仁磷酸蛋
