《可溶性肿瘤坏死因子α受体基因修饰树突状细胞和骨髓细胞联合cd40l单抗对gvhd的抑制作用的效果比较和机理研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《可溶性肿瘤坏死因子α受体基因修饰树突状细胞和骨髓细胞联合cd40l单抗对gvhd的抑制作用的效果比较和机理研究（59页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第二军医大学 硕士学位论文 可溶性肿瘤坏死因子-受体基因修饰树突状细胞和骨髓细胞联 合CD40L单抗对GVHD的抑制作用的效果比较和机理研究 姓名：李永梅 申请学位级别：硕士 专业：内科学（血液肿瘤） 指导教师：楼国良;曹雪涛 20030501 第= 军医大学硕士研究生论文 G V H D G V L T N F o 【 T N F R s 丁N F r s T N F 卜口5 5 ：F c A d m s T N F r - p 5 5 D C i D C B M D C B M C r m G M C S F I L P F U L a c Z I F N Y F A C S M O I
2、r H 】一T d R a l l o M L R C T L F I T C P E E L I S A T G F 1 3 B M T T h A P C s F C S R P M l l 6 4 0 E ：1 、 M i H A s 中英文缩写对照 移植物抗宿主病 移植物抗白血病 肿瘤坏死因子a 肿瘤坏死因子c c 受体 可溶性肿瘤坏死因子受体 可溶性肿瘤坏死因子受体p 5 5 融合蛋白 编码小鼠s T N F r p 5 5 基因的重组复制缺陷的腺病毒载体 树突状细胞 非成熟D C 骨髓来源的树突状细胞 骨髓细胞 重组的小鼠粒巨细胞克隆刺激因子 白细胞介素 p l a q u ef
3、o r m i n gu n i t s ( m 1 ) 空斑形成单位 半乳糖苷酶 y 干扰素 流式细胞技术 重复感染度 氚标记的胸腺嘧啶 同种混和淋巴细胞培养 细胞毒性淋巴细胞 硫氰酸荧光素 藻红蛋白 酶联免疫吸附分析法 转化生长因子1 3 骨髓移植 T 辅助细胞 抗原提呈细胞 胎牛血清 台成细胞培养液 效靶比例 次要组织相容性抗原 第；军医大学项士研究生论文 可溶性肿瘤坏死因子。受体基因修饰树突状细胞和骨髓细胞联合 C D 4 0 L 单抗对G V H D 的抑制作用的效果比较和机理研究 ( 中文摘要) 异基因骨髓移植( A l l o B M T ) 现已广泛应用于恶性血液病、非恶性难治
4、性血 液病、遗传性疾病和某些实体瘤的治疗，并获得了较好的疗效。但移植物抗宿主 病仍是A l l o B M T 后较严重的并发症，导致多器官损伤，免疫失调和感染，以至 于接受M H C 相配或无关供者的移植后的患者1 0 - 5 0 因这种严重的并发症而死 亡。这些患者中，G V H D 是由供者骨髓或外周血中的T 淋巴细胞识别宿主细胞 表面组织相容性抗原引起的免疫反应。这些抗原由抗原提呈细胞( A P C s ) 提呈 后，通过M H C I 、1 1 分子结合于供者T 细胞，从而激活T 细胞，发生G V H D 。 T 细胞和供者A P C s 的交互作用在诱导G V H D 的发生中起非
5、常重要的作用。树 突状细胞( D C ) 是专职的A P C s ，是初始免疫应答的有效激活剂，能直接提呈受 者m i H A s 给供者T 细胞。骨髓来源的D C 经血液循环到外周组织，对“危险” 信号做出反应，分化成熟，活化，高表达M H C 分子、共刺激分子、黏附分子和 趋化因子，随后D C 游移到淋巴器官，介导T 辅助或细胞毒性T 淋巴细胞反应。 因此了解A l l o B M T 后D C 的活化情况、T 细胞一D C 的交互关系和T 细胞的扩增 对阐明G V H D 在细胞和分子水平的发病机理非常重要。 肿瘤坏死因子一Q ( t u m o rn e c r o s i sf a
6、c t o r = a ，T N F a ) 是由激活的单核细胞、 巨噬细胞、活化的T 淋巴细胞和树突状细胞产生的具有广泛的生物学活性的前 炎性细胞因子。能够启动和加重放化疗所致的组织损伤，而且T N F o 分泌水平 过高可抑制造血。T N F - d 是G V H D 细胞因子网络的重要成员，它至少表现在三 个方面：第一，T N F c 【可直接引起对宿主组织的细胞毒性：第二，T N F d 可增强 M H C 分子和黏附分子的表达，从而大大增强宿主体内供者T 细胞的活化：第三， 丁N F c 【可以作为一种自分泌的T 细胞生长因子，能增强T 细胞的克隆表达。因 此，有学者应用T N F
7、一。拮抗剂或抗T N F a 抗体治疗严重的G V H D ，取得了一定的 疗效。T N F a 的生物学活性是由细胞膜上两种结构相关但功能完全不同的受体 介导的，分别为T N F R I ( 5 5 K D ，P 5 5 ) 和T N F R I I ( 7 5 K D ，P 7 5 ) 。水解后产生 Y o n g m e iL i ，C h a n g h a iH o s p i t a l S e c o n dM i l i l m yM e d i c a lU n i v e r s i t y , S h a n g h a i , 2 0 0 d , 3 3 第二军医夫学硕
8、士研究生论支 的P 5 5 一T N F R 和P 7 5 一T N F R 为可溶性T N F 受体，相应称为s T N F r P 5 5 和s T N F r P 7 5 。 s T N F R 具有中和及拮抗T N F n 的作用，是体内自然存在的T N F Q 拮抗剂。T N F - t l 是D C s 系生成早期必需的细胞因子，在G M C S F 培养体系中加入T N F o ，可显 著增加D C s 的生成，并明显刺激D E s 的成熟。鉴于T N F a 在D C s 成熟过程中的 重要作用，我们设想阻断T N F a 的作用将会延缓或阻滞D C s 的成熟过程，从而 降低
9、D C 对T 细胞的刺激活性。 供者T 细胞的活化和增殖需要两个信号：移植物作为一种抗原首先被A P C 递呈，形成M H C 抗原分子复合物，与T 细胞表面受体结合，产生第一信号，然 后在第二信号的辅助下，使T 细胞活化，转而对移植物抗原进行攻击，使移植 物发生排斥。如没有第二信号的辅助，这些T 细胞将保持静息状态，不呈现攻 击性。而T 细胞的活化必须由双信号识别系统进行介导，仅有抗原刺激信号还 不足以活化T 细胞，必须有共刺激分子辅助信号，两者协同才可启动免疫级联 反应，发挥免疫功能。C D 4 0 与C D 4 0 L 相互作用，可产生一种重要的第二信号， 辅助T 细胞的活化。而且大量文
10、献表明C D 4 0 C D 4 0 L 相互作用在A P C s 活化、 C D 4 和C D 8 + T 细胞激活及效应细胞的成熟过程中扮演了十分关键的作用，靶向 C D 4 0 L 的治疗具有防治G V H D 和移植排斥的潜力。 我们研究了s T N F R p 5 5 基因转染后非成熟D C 的性状、表型和功能的变化以 及在诱导同种抗原特异性的免疫耐受的作用和效果：通过建立小鼠G V H D 模型， 观察s T N F R 基因转染的骨髓细胞和D C 联合抗C D 4 0 单抗防治小鼠G V H D 的可 行性和有效性，并对其免疫学机制进行了分析。 第一部分可溶性肿瘤坏死因子受体基因
11、修饰的树突状细胞和骨髓细 胞的生物学特性研究 D C 处于不同分化发育阶段具有不同的表型特征和功能。成熟D C 的特征是 细胞表面能表达一系列如C D 4 0 、C D 8 0 和C D 8 6 等的共刺激分子，高表达M H C I 、1 1 分子，具有较强的抗原提呈能力。而未成熟D C 虽具有强大的抗原摄取能 力，但它们对T 细胞的刺激能力相对较低，并且病毒感染后的D C 在混合淋巴细 胞反应中完全丧失了刺激同种T 细胞的能力。许多研究已阐明细胞因子在体内 D C s 的成熟和分化过程中发挥着重要的作用。骨髓来源的单核前体细胞在 Y o n g m e iL i ，C h a n g h a
12、 iH o s p i t a l ，S e c o n dM i l i t a r yM e d i c a lU n i v e r s i t y , S h a n g h a i 2 0 0 4 3 3 1 第二军匝夫学硕士研究生论文 G M C S F 的作用下发育为D C 前体后，需T N F - n 的作用才能进一步发育成熟； 阻断T N F C l 的作用可以抑制D C 的成熟和分化。鉴于T N F - d 在D c 成熟过程中的 重要作用，我们设想阻断T N F a 的作用可以减缓或阻止D c 的成熟过程。在D e s 介导免疫治疗疾病的研究中，发现基因转染的D c 疫苗
13、能提供更多更有效的可供 识别的抗原表位，且可以最终克服H L A 限制。因此本实验利用可溶性T N F ( 7 1 受 体( s T N F R ) 基因修饰骨髓细胞来源的D c 和骨髓细胞，观察了基因修饰的D c 的 表型特征和功能特点及其与免疫耐受的关系。 首先将来源于B A L B c 小鼠的骨髓细胞在体外与G M C S F ( 2 0 n g m 1 ) 、I L 一4 ( 1 0 n g m 1 ) 共同培养，5 天后利用s T N F R p 5 5 重组腺病毒将s T N F R p 5 5 基因转 染入未成熟D C ，M O I 值分别为1 ：5 0 ，l ：1 0 0 ；或
14、将B A L B c 小鼠的骨髓细胞在 体外与G M C S F ( 2 0 n g m t ) 共同培养，3 天后将s T N F R p 5 5 基因转染入G M C S F 短期培养的骨髓细胞。分别在不同的时间收集上清，用E L A S A 试剂盒检测上清 中s T N F R p 5 5 的表达。结果发现当以M O I 值为I ：1 0 0 时1 2 小时后即可在D C 的培养上清中检测到高水平的s T N F R p 5 5 的表达，转染3 天后仍持续表达高水 平的s T N F R p 5 5 。转染G M C S F 短期培养的骨髓细胞，6 小时后即可达高峰。说 明腺病毒载体能有
15、效地将s T N F R p 5 5 基因转染入D C 和G M C S F 短期培养的骨 髓细胞中。 其次观察基因修饰的D C 与C 5 7 B L 6 小鼠的T 细胞M L R 反应后，对同种T 细胞的刺激能力及培养上清中T h l 或T h 2 来源的细胞因子分泌变化。发现 s T N F R - p 5 5 基因修饰的D C 与同种T 细胞培养后，其M L R 反应明显低于未转染 基因的未成熟D C 及L a c Z D C 组。I L 1 2 的分泌与未成熟D C 对照组相比无明显 的差异：但经L P S 刺激后s T N F R p 5 5 基因修饰后可明显抑制L P S 刺激对D
16、 C 表 面分子C D 4 0 、C D 8 6 及M H CI I 类分子的表达及I L 1 2 的上调作用。由于外源性 L P S 可促进D C 以自分泌方式分泌T N F a 、进一步促进D C 迅速成熟，本结果 表明基凼修饰的非成熟D C 具有较低的同种刺激活性。 进一步观察基因修饰的D C 在二次同种M L R 中，对诱导抗原特异性T 细胞 低反应性的影响。发现s T N F R D C 抗原提呈能力明显低于非成熟型D C 和L a c - Z 对照绍。检测同种M L R 反应体系上清中细胞因子的水平，发现B L A B c 小鼠来 源的s T N I ? R 基因修铂j 的未成熟D C 与新鲜分离的C 5 7 B L 6 小鼠T 细胞做M L R Y o n g m e iL i C h a n g h a iH o s p i t a l ，S e c o n dM i l i t a r yM e d i c
