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1、第四章 抗菌药物敏感试验 黄露萍 抗菌药物敏感试验 测定抗菌药物在体外对病原微生物有无 抑菌或杀菌作用的方法称为抗菌药物敏 感性试验（Antimicrobial Susceptibility Test），简称药敏试验（AST）。 药敏试验的意义 预测抗菌治疗的效果； 指导抗菌药物的临床应用； 发现或提示细菌耐药机制的存在，能帮助临 床医生选择合适的药物，避免产生或加重细 菌的耐药； 监测细菌耐药性，分析耐药菌的变迁，掌握 耐药菌感染的流行病学，以控制和预防耐药 菌感染的发生和流行。 药敏试验 MIC：在与微生物生长速率有关的特定 时间间隔内，通常是1824小时，能够 抑制被测菌生长的最低药物浓
2、度。 对倍稀释的优点： 操作容易 敏感株的MIC呈正态分布 区分异常(R)与敏感(S)的菌群 药敏试验折点的建立 1. MIC的分布 2. 药代动力学和药效学 定 MIC的折点 3. 临床疗效和细菌清除率 4. 抑菌圈直径的分布 定抑菌圈折点 统计学的线性回归 计算错误率：尽可能减少极重要误差 (假敏感率) MIC的分布 药代动力学和药效学 药代动力学：药物吸收，分布，代谢，排泄 药效学：药物对机体的作用 时间依赖型（TMIC：-内酰胺类，大环内酯类 浓度依赖型（AUC/MIC比率：AGS, FQ 这些参数可用于计算具有最佳药效的给药方案 MIC与抑菌圈直径的线性关系 耐药 中介 敏感 R I
3、 S Log2. MIC D 1 d2 抑菌圈直径（mm) v 抑菌圈直径与MIC的关系 不同国家的判定折点 可能不同 原因： 用药剂量不同，服药的间隔不同 评价敏感时较保守 更强调检测出耐药株（即特定的耐药群） 技术因素：接种、培养基 在我国主要遵循临床实验室标准化委员会（Clinical and Laboratory Standards Institute, CLSI）制定的抗菌药 物选择原则。 CLSI的简单介绍 NCCLS （The National Committee for clinical laboratory Standards） 美国临床实验室标准委员会 已经被我国卫生部指定
4、为部颁标准 每年有新版 CLSI （Clinical and Laboratory Standards Institute） 美国临床实验室标准化研究所 2012年 CLSI临床微生物检验标准及操作规范 M100-S20Tables：抗菌药物敏感性试验的实施标准 M2-A10：纸片扩散法敏感性试验的实施标准 M07-A8：需氧菌稀释法敏感性试验方法 M11-A7: 厌氧菌敏感性试验方法 M47-A8: 血培养的原则和步骤 M35-A2: 细菌及酵母样真菌的鉴定方法简本 * * M100 M100 每年更新一次每年更新一次 *M2, M7 *M2, M7 每三年更新一次每三年更新一次 3 判断折
5、点 特殊的耐药监测 标准菌株质控范围 药物分组 敏感性分类(CLSI的定义) 敏感（Susceptible） 用常规用量治疗有效 常规用药时达到的平均血药浓度超过细菌的 MIC 5倍以上。 耐药（Resistance） 用常规用量治疗不能抑制细菌的生长 MIC高于药物在血、体液中可能达到的浓度 敏感性分类（2） 中介 (Intermediate) MIC接近血、体液中药物的浓度，治疗 反应率低于敏感株 药物生理浓集部位有效 (尿-FQ) 加大用药剂量可能有效 缓冲区：防止操作的系统误差造成重 大结果的判定错误 药敏试验的方法学 半定量纸片扩散法 (抑菌圈直径) MIC法： 稀释法(肉汤、琼脂)
6、 自动化仪法 抗生素连续梯度法 (Etest ) 流式细胞仪 将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼 脂平板上，纸片中所含的药物吸收琼脂中水分溶解后 不断向纸片周围扩散形成递减的梯度浓度，在纸片周 围抑菌浓度范围内测试菌的生长被抑制，从而形成无 菌生长的透明圈即为抑菌圈。 抑菌圈的大小反映测试菌对测定药物的敏感程度， 并与该药对测试菌的MIC呈负相关关系。 纸片扩散法（Kirby-Bauer法） 操作方法 ： 1.将在约56恒温的无菌M-H琼脂倾注直径为90mm的平板，其 厚度4mm。 2.无菌挑取孵育1624h的血平板上45个菌落。 3.置于无菌生理盐水中，校正其浊度于McFarlan
7、d No 0.5管。 4.用无菌棉签浸入细 菌悬液中，将拭子在 试管上壁轻轻挤压以 挤去过多的菌液。棉 签在三个方向均匀抹 琼脂表面（每次转 60）使菌液均匀分 布，最后沿平板内缘 涂抹一周。 5.平板置室温干燥35分钟，用无菌镊子或纸片分配器 将抗菌纸片粘贴于M-H琼脂的表面，一旦纸片贴上，不 能移动；各抗菌纸片中距离应大于24mm，纸片距平板 内缘应大于15mm。 6.盖上平板的盖子，置35培养箱内孵育1618小时后 阅读结果，对苯唑西林和万古霉素敏感等应孵育24小 时。 7.7.用游标卡尺或直尺量取用游标卡尺或直尺量取 抑菌环直径，根据抑菌环直径，根据CLSICLSI标标 准，报告细菌对
8、该抗生素准，报告细菌对该抗生素 敏感敏感(susceptible,S)(susceptible,S) 、 耐药耐药(resistant,R)(resistant,R)、 中介中介(intermediate,I)(intermediate,I) 。 *25 纸片扩散法影响因素 MIC 接种菌量 细菌生长率 抗生素含量、扩散性 平皿厚度 温度，预孵育时间 *26 纸片扩散法标准化 CLSI：美国实验室标准化委员会(Clinical and Laboratory Standards Institute) 每年修订更改 包括质控 新药的判定标准 特殊耐药性的检测 *27 CLSI的法规 规定纸片含量、
9、接种浓度、培养基、平 皿厚度、判定标准、质控； 规定常规测试报告的抗生素； 不同的药判定标准不同； 不同的菌判定标准也不同。 *28 常规测试并报告的药物分组(1) 肠杆菌科 绿脓和非肠杆菌科 一 级 氨苄西林 头孢他啶，庆大霉素 头孢唑林，庆大霉素替卡西林，哌拉西林 二级 阿米卡星 阿米卡星 氨苄西林/舒巴坦 头孢吡肟，头孢哌酮 阿莫西林/克拉维酸氨曲南 头孢呋肟，头霉素环丙沙星，亚胺培南 头孢噻肟，头孢曲松 替卡西林/克拉维酸 环丙沙星，亚胺培南 妥布霉素，复方磺胺 替卡西林，哌拉西林 三级 氨曲南，头孢他啶头孢曲松 卡那霉素，奈替米星 氯霉素，奈替米星 妥布霉素 四环素，氯霉素 *29
10、常规测试并报告的药物分组(2) 葡萄球菌肠球菌 一级 苯唑西林，青霉素 青霉素，氨苄西林 二级 红霉素类万古霉素 克林霉素，万古霉素 三级 氯霉素庆大霉素 *30 常规测试并报告的药物分组(3) 流感嗜血杆菌肺炎链球菌 一级 氨苄西林，青霉素青霉素，红霉素 复方磺胺 复方磺胺 二级 头孢呋肟，头孢噻肟氧氟沙星，四环素 头孢他啶，氯霉素 万古霉素 三级 阿奇霉素，头孢克罗氯霉素，利福平 环丙沙星，亚胺培南利福平，四环素 *31 预报用药(一) 测试药菌名推测其他药物的敏感性 苯唑西林 葡萄球菌所有-内酰胺类 四环素所有（除葡多西环素，米诺环素 萄球菌和不 动杆菌 红霉素G球菌罗红霉素，克拉霉素，
11、 阿奇霉素 克林霉素所有林可霉素 *32 预报用药(二) 测试药菌名推测其他药物的敏感性 氨苄西林肠球菌青霉素 青霉素G葡萄球菌氨苄西林，美洛西林 替卡西林 头孢噻吩肠杆菌科头孢拉定，头孢氨苄 头孢克罗 奈啶酸肠杆菌科所有氟喹诺酮类 万古霉素所有替考拉宁 以一定浓度的抗菌药物与含有被试菌株的培养基进 行一系列不同倍数稀释（通常为双倍稀释），经培 养后观察其最低抑菌浓度。 稀释法中用琼脂培养基者为琼脂稀释法，用肉汤培 养基者为肉汤稀释法。 药敏试验-稀释法 常用抗菌药物容积稀释法 步骤浓度 （mg/mL） 来源 体积 (mL) CAMHB (mL) 最终浓度 （mg/mL） 15120储存液19
12、512 2512步骤111256 3512步骤113128 4512步骤11764 564步骤41132 664步骤41316 764步骤4178 88步骤7114 98步骤7132 108步骤7171 111步骤10110.5 121步骤10130.25 131步骤10170.125 原理： 聚乙烯板内含有各种稀释度的抗菌药物，实验时 加入100l浓度为105 CFU/ml的菌液，盖上盖板，35 1620h观察结果。孔底部清晰不出现细菌沉淀的最低 抗菌药物浓度即为该抗菌药物对细菌的最小抑菌浓度， 通过CLSI标准判断其敏感和耐药。再取0.01ml容量接种 环取肉眼观察无菌生长的液体接种于血琼
13、脂平板作次代 培养，经35过夜培养后观察最低抗菌药物浓度能杀死 99.9原始种入的细菌即为该菌的最低杀菌浓度(MBC) 。 微量液体稀释法 (microdilution test) 操作方法：1.抗菌药物的稀释和融解 2.在微量聚乙烯微板孔中加入各种不同浓度的抗生素 100l，从低浓度往高浓度加样，不需要更换吸管 。 3.挑选1824小时的菌落置M-H肉汤增菌46小时。 4.制备0.5麦氏比浊管，然后1:200稀释，使之最终 浓度105 CFU/ml。 5.用微量加样器接种100l 到96孔中，盖上盖板。 同时作阳性、阴性对照。 6.手工看浊度或仪器自动 判读。按照CLSI标准报 告细菌对某抗
14、菌药物为 敏感、耐药和中介。 阅读结果的正确光源 细细 菌菌反射光反射光透射光透射光细细 菌菌反射光反射光透射光透射光 肠杆菌科细菌肠杆菌科细菌 肺炎链球菌肺炎链球菌 (移去盖子移去盖子) ) 铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌 - - 、草绿色链、草绿色链(移去盖子移去盖子) ) 不动杆菌属细菌不动杆菌属细菌 嗜血杆菌属嗜血杆菌属 伯克霍尔德菌伯克霍尔德菌 淋病奈瑟菌淋病奈瑟菌 (移去盖子移去盖子) ) 葡萄球菌葡萄球菌 VANVAN、OXAOXA、 LINLIN 脑膜炎奈瑟菌脑膜炎奈瑟菌 (移去盖子移去盖子) ) 肠球菌肠球菌 VANVAN 弧菌属弧菌属 注：阅读葡萄球菌中应注意的纸片法药敏结果是任何有可见的菌落生长均应视作 对VANVAN、OXAOXA、LINLIN抗菌药物耐药 *41 肉汤稀释法 4 8 16 32 64 128 256 ug/ml
