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1、人体免疫功能的检测 第一节 免疫应答的类型及组成 免疫应答分两种类型 一.非特异性免疫应答 二.特异性免疫应答 一.非特异性免疫应答（固有性免疫应答， innate immune response) （一）概念 先天获得，无个体差异 （二）特点 1.起作用迅速 2.先天获得 3.无个体差异 4.不因同一抗原进入机体次数多少改变反应强 弱 （三）组成 1.皮肤、黏膜的机械阻挡作用及局部分泌的抑 菌、杀菌物质 2.吞噬细胞 3.NK(nature killer)细胞对病毒感染靶细胞的 杀伤作用 4.血液、体液中的抗菌有关分子：补体、溶菌 酶 二.特异性免疫应答（适应性免疫应答， adaptive
2、immune response) （一）概念 后天因抗原刺激获得 （二）特点 1.后天获得 2.免疫发生时间因首次或再次接触抗原而不同 3.有个体差异 4.免疫发生强弱与抗原进入次数有关 （三）组成 细胞免疫：由T细胞主导完成 体液免疫：由B细胞主导完成 第二节 人体免疫功能检测 非特异免 疫功能 体液中杀菌物质补体、溶菌酶 吞噬细胞大、小吞噬细胞（数 量、 功能） 特异性免 疫功能 细胞免疫 功能 T细胞 数量 功能 体液免疫 功能 B细胞 数量 功能 人特异免疫功能的检测 一. T细胞数量的检测 二. T细胞功能的检测 三. B细胞数量的检测 四. B细胞功能的检测 一.T细胞的计数（T细
3、胞表面标志的检测 ） （一）特异性抗原的检测 T细胞表面有一些特异的CD抗原，根据这 些不同的CD抗原可鉴定不同的T细胞群体 T细胞表面主要CD抗原及其特异性 CD抗原 特 异 性 CD2 E受体、全部T细胞和部分NK细胞 CD3 成熟T细胞 CD4 T（辅助/诱导）细胞、M、HIV受体 CD8 T（杀伤/抑制）细胞、NK细胞的亚型 CD25 活化T细胞、IL-2受体 检测T淋巴细胞表面CD抗原中： CD3+的数量 表示总T淋巴细胞的数量 CD4+的数量 表示是Th细胞的数量 CD8+的数量 表示是Ts细胞的数量 一般更重视CD4+/CD8+的比值，正常应1.5 ，免疫功能差或者免疫功能紊乱，
4、此比值往往 小于1。 检测T细胞方法： 用标记的抗CD抗原的单克隆抗体检测 1.间接免疫荧光法：用荧光素标记的单抗作为 试剂染色淋巴细胞，计算出染上荧光的淋巴细 胞百分率 如：荧光标记的抗CD4 淋巴细胞 染上荧光的细胞为CD4+细胞 染色 2.免疫细胞化学法： 用酶标记的单抗检测淋巴细胞 淋巴细胞 淋巴细胞表面CD 抗原与相应单抗结合 加底物 细胞上有颜色为阳性细胞 用酶标记的单抗 洗涤洗涤 染色 3.抗体致敏细胞花环法 用相应单抗致敏红细胞（单抗结合到红细 胞表面），与淋巴细胞混合 有相应抗原的T细胞周围可吸附红细胞，形 成花环 （二）T细胞特异性受体（E受体）的检测 E花环形成试验 (E
5、rythrocyte Rosette forming test) 原理： T淋巴细胞表面有绵羊红细胞（SRBC) 受体，当淋巴细胞与绵羊红细胞混合时， T细胞通过该受体吸附绵羊红细胞，形成 的花环。 E:erythrocyte, 红细胞 E花环形成试验据实验条件不同又分两种 ： Et花环形成试验（total, 总E花环） Ea 花环形成试验（active,活性E花环 ） 1.Et花环形成试验 淋巴细胞 + SRBC (1: 2050) 37 C 、5分 钟 低速离心 4C、2 h or 过夜 形成花环的百分率 意义： 表示总T细胞数量（凡是T细胞均能形成 花环），数量低于正常，说明细胞免疫功能
6、 不好。 正常值：60%80% 2.Ea花环形成试验 淋巴细胞 + SRBC (1 : 8-15) 37C、 5分钟 低速离心 计数花环形成百 分率 意义： 能形成Ea花环的T 细胞是活性强的T细胞，Ea 花环形成率更能反映细胞免疫功能的情况。正 常值：20%30% （三）T细胞的 - 醋酸萘酯酶测定 ( - acidnaphthyl acetate esterase , ANAE) 成熟的T细胞中富含ANAE - 醋酸萘酯 醋酸 + 萘酚 红色沉淀 暗红色 该试验将T淋巴细胞染成暗红色。正常值 6080% ANAE 酸性时水解 六偶氮品红 偶联 甲基绿 复染 二.T细胞功能的检测 反映机体细
7、胞免疫功正常，除了要T淋巴细胞 数量正常外，还要T细胞功能正常。 检测T细胞功能正常的试验有： （一）淋巴细胞转化试验 （二）相关的细胞因子的检测（在细胞因子章 节介绍） （三）淋巴细胞的细胞毒性检测 （一）淋巴细胞转化试验 1.原理 淋巴细胞在某些物质刺激下，细胞增殖、 分化（如细胞变大、胞浆增多、出现空泡） DNA合成增加：细胞核疏松，核仁出现，即为 淋巴母细胞。 淋巴细胞受到刺激物刺激是否易发生转化 与其功能好坏有关，功能好的易转化，故可 通过转化率了解其功能情况。 2.刺激物 一般为有丝分裂原和抗原 分两类 （1）非抗原刺激物（有丝分裂原） 可刺激相关的一类淋巴细胞发生转化 ，与机体是
8、否已曾受过某一抗原致敏无关 。常有： 非抗原刺激物 刺激物 能刺激发生转化细胞 植物血凝素 T (phytohemagglutinin, PHA) 刀豆素A T (Concanavalin A, Con A) 脂多糖 (LPS) B 美洲商陆(PWM) T、B （2）抗原刺激物 只能使已经被相应抗原刺激（致敏）过的 淋巴细胞发生转化。如结核菌纯蛋白衍化物 (purified protein derivative， PPD)，作 为刺激物，只能刺激曾经接受过结核菌刺激的 淋巴细胞（部分 T 细胞）发生转化，故用抗 原刺激物做淋巴细胞转化试验其转化率正常时 均低于用有丝分裂原刺激的。如用PPD做淋
9、巴 细胞转化试验正常值：15%-20%；用PHA刺激的 淋巴细胞转化率应为60%-80%。 3.试验方法 （1）形态学检测法 将待测者血取出，加入一定量刺激物（ 一般用PHA )培养，3天后涂片染色，计数转化 淋巴细胞（根据形态）的百分率。正常值 60%80% 操作过程： 试验管:抗凝血0.5ml +PHA2mg +培养液 对照管：抗凝血+ 培养液 37 C 5%co2 培养3天 涂片染色 计数转化淋巴细 胞百分率 转化与未转化淋巴细胞的区别 转 化 细 胞 未转化细胞 特 点 母 细 胞 过 渡 型 小淋巴细胞 细胞大小（直径） 1220 1216 68 胞 核 染色质 疏 松 疏 松 致
10、密 核仁 13个 有或无 无 分裂相 有或无 无 无 量 丰 富 稍 宽 窄 嗜碱性 强、深兰色 兰 色 天青兰 空 泡 有或无 有或无 无 伪 足 有或无 有或无 无 胞 浆 形态学方法的优缺点 优点： 简便、不需要特殊仪器，无有害物（放 射性物质）污染。 缺点： 判断结果不客观，操作中易损害细胞， 辨认困难，结果判断难以规范化。 （2）同位素掺入法 原理： T细胞受PHA刺激后，细胞进入增殖周期进行 有丝分裂。整个细胞周期分G1、S、G2、M四个 期。在G1期合成少量DNA和蛋白质，为DNA复制 准备，S期细胞合成DNA量明显增加。试验中当 细胞进入S期时，在培养液中加入3H-胸腺嘧啶 核
11、苷（3H-TdR)，细胞摄入，合成DNA,据掺入细 胞内的同位素量，可推测细胞增殖活跃程度， 从而判断淋巴细胞转化的程度。 步骤： 外周血 分离 淋巴细胞 洗涤3次 计数并配成 1106/ml 0.1ml细胞+1640 0.1ml+PHA0.5mg/ml 37 C 54-56h 5%co2 加3H-TdR 1ci/孔 37 C 16-18h 5%co2 收集于滤膜上 8085 C 30分钟 置有闪烁液 的闪烁瓶中 用 计数仪测 cpm（每分钟 脉冲数） 计算刺激指数： 刺激指数(SI) = 实验组cpm 对照组cpm Cpm： 每分钟脉冲数 正常值：SI 3.0 同位素掺入法的优缺点 优点：
12、结果客观准确，有取代形态学法的趋势 缺点： 技术要求高，操作中每一个因素的改变都可 影响结果；需要特殊仪器检测；有同位素污染 问题 （3）MTT(四甲基偶氮唑盐） 法 原理：MTT在活细胞线粒体琥珀酸脱氢酶作用 下，被还原成兰黑色的 MTT-甲，形成MTT-甲 的量与细胞增殖程度呈正相关。淋巴细胞受刺 激物刺激增殖，细胞数增多，故通过比色法测A 值，计算出刺激指数作为判断淋巴细胞转化率 的指标。 试验孔A均值 SI= 对照孔A均值 步骤： 外周血 分离 淋巴细胞 洗涤3次 计数并配成 1106/ml 0.1ml细胞+1640 0.1ml+PHA0.5mg/ml 37 C 、68h 5%co2
13、37 C 、4h 5%co2 培养结束，取出， 1500rpm10min离心 去上清液， 每孔加100l DMSO，混匀 5min，室温放置20min后， 于酶标仪上测 570nm A值 每孔加5mg/ml MTT 10l 按公式计算SI DMSO：二甲亚砜 （二） T细胞介导的细胞毒试验 细胞毒性T细胞（CTL)具有杀伤靶细胞 的作用，它是评价机体细胞免疫水平的一 种指标之一。检测这种杀伤作用的试验称 为细胞毒试验。 CD8+CTL与靶细胞表面相应抗原结合通过脱颗粒，释放穿孔素 、颗粒酶，使靶细胞溶解、凋亡。 CTL CD8+ 靶细胞 穿孔素、颗粒酶 靶细胞 溶解、凋亡 致敏淋巴细胞 方法
14、1.形态学方法 淋巴细胞与靶细胞按一定比例加在一起培养 一段时间，染色后计数残留靶细胞（肿瘤细胞 ）数，计算淋巴细胞抑制肿瘤细胞生长的抑制 率。 对照组： 对照组平均残留肿瘤细胞数 实验组：实验组平均残留肿瘤细胞数 抑制率% = 对照组 - 实验组 对照组 100% 2.同位素法：常用51Cr释放试验 原理： 用51Cr标记靶细胞（一般为肿瘤细胞） ，将它与待测淋巴细胞（效应细胞）一起 培养，效应细胞破坏靶细胞， 51Cr释放出 来，测定其51Cr数量，便可推知效应细胞 的杀伤能力。 方法： 效应细胞：受检者外周血单个核细胞 靶细胞：用铬酸钠（Na251Cr)标记传代肿瘤细胞 分三组： 1. 最大释放组 50l靶C+150 l DW (靶细胞全溶) 2. 自发释放组 50l靶C+
