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1、第6 届家畜内科学学术研讨会论文集 髓过氧化物酶检测奶牛隐性乳腺炎的研究 郭昌明张乃生 ( 吉林大学畜牧兽医学院吉林长春13 0 0 6 2 ) 摘要：本文着重论证了对奶牛奶样中髓过氧化物酶( m y e l o p e r o x i d a s e ，R P O ) 的检测诊断隐性乳腺炎的可行性。 就乳腺炎的发生和发展过程中的生理生化指标的变化特点及乳腺炎指示物M P O 进行了系统的论述。奶样中的体细胞数 ( S C C ) 和E L I S A 检测M P O 浓度得出的相关系数值为0 9 1 。奶样中随着S C C 的增高，M P O 的水平也增高能够达到2 0 0 0 n g m
2、l 。分析M P O 单克隆抗体( A MM oa b s ) 最适浓度和最适培养浓度，检测奶样中M P O 的浓度范围为2 1 0 0 0n g m l 。 在S C C 和M P O 浓度都高的奶样中都可以分离到大量细菌。免疫学分析M P O 单克隆抗体与乳铁蛋白、乳过氧化物酶、 牛血清白蛋白、髓过氧化物酶、淋巴细胞、少量体细胞的乳样之间的E L I S A 反应没有交叉性，表明M P O 分子在乳腺炎 中具有很高的特异性。通过对奶牛奶液中M P O 的检测来判断乳房内中性粒细胞( P M N ) 的活性状态，就可以早期诊断 奶牛是否患有隐性乳腺炎。针对M P O 的单克隆抗体，本文对A
3、MM oa b s 的特异性、交叉性、灵敏度进行了详细论证。 从而得出检测奶牛乳汁中M P O 的量可以诊断隐性乳腺炎。 关健词l 隐性乳腺炎，M P O 。单克隆抗体。E L I S A 检测 S t u d y o nt h em y e l o p e r o x i d a s ed e t e c t i n gr e c e s s i v em a s t i t i s G u o C h a n g m i n gZ h a n g N a i s h e n gZ h o u C h a n g f a n gY a n g Z h e n g t a oW a i D o
4、 n gJ i n g Z h a o T oe v a l u a t et h ep o t e n t i a lo fu s i n gM P Oi nt h ed i a g n o s i so fu d d e ri n f e c t i o n si nd a i r yc a t t l eW Cd e v e l o p e da s p e c i f i ce n z y m ei m m u n o a s s a yf o rb o v i n eM P Oi nm i l k n ec h a n g eo fp h ) 7 s i o - b i o c h
5、e m i c a li n d i c a t o ra n dt h e i n d i c a t o rM P Oi nt h ed e v e l o p m e n to fm a m m i t i sa r cs y s t e m a t i c a l l yd i s c u s s e d F o rt h em i l ks a m p l e st h e c o r r e l a t i o nc o e f f i c i e n tb e t w e e nt h es o m a t i cc e l lc o u n ta n d 佃I oc o n c
6、 e n 仃a t i o n sd e t e r m i n e du s i n gt h eE L I S A w a sO 9 1 I nm i l ks a m p l e s 丽mah i g hS C C 。M P Ol e v e l sw e r ea l s oh i g h , r e a c h i n gl e v e l so fc a 2 0 0 0 n g mo p a m u ma n t i b o d yc o n c e n t r a t i o n sa n do p t i m u mi n c u b a t i o n sw e 他d e t
7、 e r m i n e db yc o n d u c t i n g c h e c k e r - b o a r dt i t r a t i o n s 1 1 1 er a n g eo fm e a s u r e m e n tw a sc a 2 1 0 0 0n g m lu s i n gp u r i f i e dM P O 鹄s t a n d a r d 。 M i c r o o r g a n i s m sw e r ei s o l a t e di nt h em i I ks a m p l e sw i t he l e v a t e dc o n
8、 c e n t r a t i o n so fM P Oa n dh i g hS C C A c c o r d i n gt Oi m m u n o b l o ta n dE U S Aa n a l y s i s t h eA MM oa b sa r cs p e c i f i ct ob o v i n eM P O a n ds h o wn oc r o s s r e a c t i v i t yw i t ho t h e rn e u t r o p h l lg r a n u l ep r o t e i n ss u c ha sl a c t o f
9、e r d n 1 a c t o p e r o x i d a s ea n ds e r u ma l b u m i n n e r e s u l ts h o w e dN 口Oi sg o o dv e r ys p e c i f i c i t yi nm i l l 【a b o u tm a s t i t i s p r e c i s i o na n da c c u r a c yi nm e a s u r i n g M P Oi nm i I kJ u d g e dM 田Oi nm i l k i tb eu s e dt oa s s e s sP 阱a
10、 c t i v ec o n d i t i o ni ni n t r a - b r e a s to fb o v i n e n e s p e c i f i c n e s s ，c r o s s w i s ea n ds e n s i t i v i t yo fA MM oa b s w e r cA r g u m e n t e di nf u Ui nt h i sa r t i c l e T h er e s u l t s c l e a r l ys h o wt h a tt h eq u a n t i t a t i v ea n a l y s i
11、 so ft h ea m o u n to fN 皿Oi nm a s t i f f sm i l kC a nb eu s e dt od e t e c t i n t r a m a m m a r yr e c e s s i v ei n f e c t i o n si nd a i r yc a t t l e k e yw o r d s ： r e c e s s i v em a s t i f f s m y e l o p e r o x i d a s e m o n o c l o n a la n t i b o d y f f u z y m c l i n
12、 k e d i m m u n o s o r b c n ta s s a y 奶牛乳房炎是世界乳牛业的主要危害因素之一。它不仅影响奶牛的产奶量，严重时使奶牛遭到淘 汰，甚至还影响乳的品质，危及人类健康。据报道，国外奶牛乳房炎的发病率约为2 0 一6 0 ，美国 每年因乳房炎引起的直接经济损失超过2 0 亿美元；而国内奶牛乳房炎的发病率大约是2 0 一7 0 ，其 直接经济损失也不少于2 1 亿人民币。据资料记载，临床型乳腺炎占奶牛总发病率的2 1 2 3 ，其淘汰 牛占奶牛总淘汰率的9 一1 0 。隐性乳腺炎流行面广，为临床型乳腺炎的1 5 4 0 倍，引起奶产量降低 4 一1 0 ，影
13、蛔牛奶质量，并易转变为临床型乳腺炎。因此，我们应该研究一种方便快捷、可推广的检 测方法对患乳腺炎的奶牛乳汁进行检测并作出早期诊断，对减少奶牛业经济损失具有重要意义u l 。 第6 届家畜内科学学术研讨会论文集 国内外奶牛隐性乳腺炎的检测方法有S C C 检测法田、手握式导电仪检测法四、凝固酶试验T C T 、单 克隆抗体的免疫方法检测( q 、D N A 指纹图技术检测法嘲、P C R 检测法等，在我国奶牛养殖情况下很难得 到广泛的应用，有许多方法还要求专业实验室操作，这对推广应用是不利的，有些方法临床应用时不 够快速、简便地作出诊断。所以需要找出一种快速、简便、准确的方法在临床上能够广泛地推
14、广。应 用现今先进的E L I S A 试剂盒和试纸条技术来检测奶牛隐性乳腺炎的方法是个新的快速便简诊断思 路。随着现代生物技术的发展，对疾病的检测深入到分子水平，应用单抗技术通过E L I S A 方法或试纸 条显色法对疾病进行检测。髓过氧化物酶可作为奶牛隐性乳腺炎的指示性物质，我们可以通过M P O 的 研究对奶牛隐性乳腺炎的检测上升到分子水平。关于奶牛乳腺炎的M P O 研究国内还未见报道在国外 瑞典的国家兽医研究所1 9 9 4 年分别报道了奶液中M P O 是乳腺炎的指示性酶类物质、奶牛M P O 的单克 隆抗体的制备及针对奶牛乳汁中M P O 的M P O - E L I S A
15、方法的建立。 1 乳房炎的发病机理 乳房炎是一种复杂的疾病，其病原菌很多，它的发生是病原、机体防卫功能和外界环境因素共同 作用的结果。葡萄球菌和链球菌占病原菌总数的9 0 以上，是引起奶牛隐性乳房炎的主要病原菌。病 原菌数中所占的比例依次为停乳链球菌( 4 0 9 1 ) 、金黄色葡萄球( 2 7 2 8 ) 、无乳链球菌( 1 3 6 4 ) 、乳房 链球菌( ( 9 0 9 ) 、大肠杆菌( ( 9 0 9 ) 此外，支原体、病毒等也可引起奶牛隐性乳房炎嘲。 乳腺炎时白细胞凭借其渗出性、变形性、趋化性及吞噬功能等生理特性而扑捉杀灭乳腺组织中 或乳房中的病原体。中性粒细胞具有高度活动性，能挤
16、过毛细血管的微孔进入身体组织之内，这种功 能称为渗出。当抗原进入体内时，引起化学物质的释出而吸引各类中性粒细胞进人入侵区域，称为趋 化性，可引起其趋化作用的物质计有C 3 a 、C 5 a 、C 5 6 7 、由活化的淋巴细胞释放的淋巴因子、生物细菌 所释放的代谢产物、组织分解产物、吞噬细胞所释放的物质两( 如髓过氧化物酶等) 。中性粒细胞、巨 噬细胞和单核细胞能包围和吞噬入侵的有机体微生物，这一过程称为吞噬作用。被激活的白细胞可释 放：颗粒酶体内容物、花生四烯酸代谢产物、氧代谢产物、细胞因子等介质以诱发炎性反应并参与炎 症反应。被激活后的白细胞释放两种颗粒：含有髓过氧化物酶及弹性酶的嗜苯胺篮体( 初级颗粒) 和 含有乳铁素的特异颗粒( 次级颗粒) 。髓过氧化物酶及乳铁素主要参与依赖氧的杀菌活动田。乳铁素为 氧自由基的产生提供绝大部分的铁。激活后的白细胞释放弹力酶降解弹力素及纤维。弹力酶还影响内 膜细胞的连接，促进血液蛋白的渗出。与此同时还有其它一些蛋白酶类唧如：过氧化物酶
