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1、天津医科大学 博士学位论文 骨髓增生异常综合征恶性造血克隆的早期识别及根治研究 姓名：岳兰竹 申请学位级别：博士 专业：内科学 血液病 指导教师：邵宗鸿 20100501 天津医科大学博士学位论文 中文摘要 目的 从免疫表型、分子生物学、细胞形态学、组织化学等方面寻找与骨髓增生 异常综合征( M y e l o d y s p l a s t i cS y n d r o m e ，M D S ) 恶性克隆负荷显著相关的辅助诊 断指标，并在体外及体内对不同方案治疗M D S 的机制及疗效进行研究。 方法 研究对象为M D S 患者7 3 例及正常对照1 2 名。第一部分采用流式细胞术 ( F
2、C M ) 检测白介素3 受体Q ( C D l 2 3 ) 和粒细胞集落刺激因子( G r a n u l o c y t e C o l o n yS t i m u l a t i n gF a c t o r , G C S F ) 受体( C D l l 4 ) 在M D S 患者骨髓中的表达情况， 从免疫表型方面寻找M D S 恶性克隆的分子标志。第二部分采用半定量R T - P C R 的方法检测d l k l ( d e l t a 1 i k e1 ) 基因在M D S 患者骨髓中的表达情况，并分析其临 床意义，从分子生物学角度探寻恶性克隆的分子标志。第三部分利用t 检验、矛
3、 检验、L o g i s t i c 回归分析等统计方法分析M D S 患者骨髓形态学、外周血象、铁 代谢等指标与典型染色体异常、恶性克隆负荷及分子遗传学进展的相关性，从 细胞形态学和组织化学等方面探索M D S 恶性克隆的标志。第四部分体外培养 M D S 患者骨髓粒巨噬细胞集落形成单位( G M C F U ) ，1 4 天后分别加入地西他 滨、H A ( 高三尖衫酯碱+ 5 可糖胞苷) 、D A ( 柔红霉素邯可糖胞苷) 等药物，采用F C M 检测7 2 h 后细胞的凋亡率及分化抗原C D ll b 、H L A D R 的表达，并采用R T - P C R 检测凋亡相关蛋白半胱氨酸
4、蛋白酶3 ( c a s p a s e 3 ) m R N A 的表达，研究不同药物对 M D S 患者G M C F U 的作用及机制。第五部分将M D S 患者根据国际预后积分系 统( I P S S ) 评分分为中低危组和高危组，对依据不同危险度实施的分层治疗疗效 进行分析。 结果 第一部分M D S 患者骨髓C D 3 4 + 细胞分化异常，C D 3 4 + C D 3 8 。C D 3 4 + 比例 ( ( 1 4 0 3 4 - 5 2 7 ) ) 显著高于对照组( ( 7 7 0 - a ：4 3 6 ) ) ( P 0 0 5 ) 。 天津医科大学博士学位论文一、骨髓增生异
5、常综合征恶性克隆细胞表面功能抗原的研究 1 2 4M D S 患者骨髓C D l2 3 + C D 3 4 + C D 3 8 一及C D l2 3 一C D 3 4 + C D 3 8 一细胞的C D l14 表达情况 共检测2 0 例患者，C D l 2 3 + C D 3 4 + C D 3 8 细胞中的C D l l 4 平均表达率为 ( 3 4 8 2 - 土：2 9 5 8 ) ，C D l 2 3 C D 3 4 + C D 3 8 细胞中的C D l l 4 平均表达率为 ( 5 3 4 8 士2 7 4 1 ) ，前者显著低于后者( P 9 0 ) ， 而正常人的C D 3
6、4 + C D 3 8 细胞中几乎检测不到C D l 2 3 ( 0 0 5 ) 。 ( 7 ) 血常规、L D H 、铁代谢等指标与恶性克隆负荷的关系 我们将有无染色体异常两组患者的血常规、乳酸脱氢酶( L D H ) 、血三项、 铁四项等临床指标进行分析，结果如下，见表3 1 1 表3 1 4 。染色体异常组的铁 蛋白水平显著高于染色体正常组( 尸 0 6 ) 和低 恶性克隆负荷( 2 2 0 n g m L 、U I B C 2 2 0 n g m L 、U I B C _ 1 0 0 x 1 0 9 L 、无原 始细胞、血细胞无发育异常表现( 绝对值必须在不用造血生长因子的情况下至 少
7、维持2 个月) 部盆缓鲤( 垦2 P B 绝对值需至少维持2 个月 B M 原始细胞较前减少5 0 或更多：或与之前F A B 亚型相比转变为较轻的 亚型( 不管有核细胞增生程度和发育异常表现) 其余同C R 标准 鱼遮堂邀羞! H 1 2 ：改善值必须在不用细胞毒药物治疗的情况下，至少维持2 个 月 红细胞和血红蛋白 显效：治疗前H b 1 5 将 R C M D 。R S 单列为一个亚型。然而，正如R A E B 患者有无环铁预后均较差，环铁 1 5 对于R C M D 患者的预后亦没有改善作用【3 刀，故而2 0 0 8 W H O 分型合理地将 R C M D R S 与R C M D
8、 合并为一个亚型。此外，许多学者指出2 0 0 1 W H O 分型中 没有强调外周血原始细胞增多对于预后的重要意义【3 8 J 。由此，2 0 0 8 W H O 分型对 R A E B 的诊断进行补充：若骨髓原始细胞 5 ，但外周血原始细胞达到2 4 ， 同样可诊断为R A E B 1 ；外周血原始细胞达到5 1 9 、骨髓原始细胞达到 1 0 1 9 或见到A u e r 小体，满足三者之一即可诊断为R A E B 2 。 2 0 0 8 W H O 分型正式增设儿童M D S 亚型，将外周血原始细胞 2 、骨髓原 始细胞 5 、两系及以上病态造血的儿童M D S 列为R C C 。对于
9、外周血原始细胞 在2 1 9 和( 或) 骨髓原始细胞在5 1 9 的患儿则可依据成人M D S 分型进 行诊断。儿童M D S 与成人不同之处在于儿童R A 较少见，而多表现为粒细胞减 及或血小板减少，且骨髓多为低增生。由此，儿童M D S 须注意与再障及先天性 骨髓衰竭症相鉴别。关于R C C 与成人的R C M D 是否有区别、区别在何目前尚不 清楚，仍须进一步研究以明确，因此R C C 仍是一个临时亚型。 至于低增生M D S 及M D S F ，2 0 0 8 W H O 分型仍未将其单独增设亚型，可能 由于具体亚型的定义或其必要性尚未达成共识。因此，这类患者仍按照W H O 分 型
10、进行诊断，如“R A E B 2 伴骨髓纤维化”、“低增生R C M D ”等。该问题引发人 们思索，一个疾病实体须具备哪些特点才足以将其单独列为一种疾病或一种亚 型。一般认为，需有足够的证据证明该疾病具有独特的临床表现及特异的治疗 天津医科大学博士学位论文 综述 方法。 值得一提的是，在2 0 0 8 W H O 分型中，难治性血细胞减少伴有M D S 相关的 克隆性分子遗传学异常患者被考虑“推测为M D S ”，即便他们不具有形态学的异 常。可见，2 0 0 8 W H O 分型进一步强调了分子遗传学在M D S 诊断及预后中的重 要性，预示着分子遗传学将成为继传统形态学方法诊断M D S
11、 之后的一个新的重 要工具。分子遗传学异常对于M D S 及A M L 的诊断均较重要，但在A M L 中多 见平衡性染色体易位，可通过F I S H 及其他方法检测，而在M D S 则常有大片段 缺失、多位点破坏及染色体数量的异常，且多数异常尚不清楚是由何种特异性 基因改变所导致。目前在M D S 患者己发现众多分子遗传学异常，包括多种基因 突变、染色体缺失及易位等【3 9 啦】，但尚未发现与M D S 相关的特异性改变。M D S 患者是否具有特异性的基因异常，正如骨髓增殖性疾病中的J A K 2 突变，抑或 M D S 的分子遗传学异常也像其形态学改变一样多样化，仍有待进一步研究。 此外
12、，对于免疫表型异常在M D S 诊断中的意义，2 0 0 8 版W H O 分型的态度 是随访观察，仅有免疫表型异常，而缺乏特异性形态学或分子遗传学异常的患 者是不足以诊断为M D S 的，须严密随访监测其变化。 对于维也纳标准中提到的I C U S ，2 0 0 8 W H O 标准给予进一步肯定，确有此 类患者的存在，并指出I C U S 并不属于M D S 分类中的某个亚型，而是尚不符合 M D S 最低诊断标准的一类患者。该类患者须严密随访，以及时发现具有M D S 特征性的形态学或分子遗传学改变。 总而言之，2 0 0 8 版W H O 分型在较2 0 0 1 版分型进一步完善、细化
13、的同时， 仍体现出以细胞形态学、组织化学、分子遗传学、免疫表型等多指标综合诊断 M D S 的思想。在过去近几十年的研究中，M D S 已由最初的病态造血综合征纯化 为造血干细胞恶性克隆性疾病，其诊断方法亦从单纯形态学标准演变为现今的 多指标综合诊断。今后的研究中，不断挖掘新的灵敏、特异的指标将使M D S 的 诊断标准日臻完善。 2 骨髓增生异常综合征的治疗策略 早在二十年前，M D S 的治疗手段十分贫乏，仅限于成分输血、抗生素对抗 感染等支持治疗。如今，无论低危M D S 还是高危M D S 均已有多种治疗选择。 5 氮杂胞苷、雷利度胺、地西他滨己被美国F D A 批准应用于M D S
14、的治疗H 3 4 5 1 ， 加之E P O 、G C S F 等造血刺激因子的应用，M D S 患者的治疗策略较以往大为改 天津医科大学博士学位论文综述 观。不仅如此，促血小板生成类药物以及多种药物联合应用对于M D S 的疗效正 在积极探索中【4 6 4 7 1 ，使得M D S 的治疗前景亦极其令人憧憬。现对M D S 目前的 治疗策略作一概述。 目前，基于不同危险度实施分层治疗是M D S 治疗的主导思想【4 8 5 1 1 。低危 M D S 包括F A B 分型及W H O 分型中骨髓原始细胞 5 ( 凡垣B 1 ，R A E B 2 ) 的亚型或I P S S 积分芝1 5 (
15、I P S S I n t 2 ，H i g l l ) 的患者。 就总体治疗目标来说，低危M D S 治疗致力于减小输血需求、恢复骨髓有效 造血及提高生活质量，多采用刺激造血、改善骨髓造血微环境等治疗【5 2 】：高危 M D S 则争取获得部分缓解( P R ) 或完全缓解( C R ) 以延长生存时间，多使用大 剂量化疗及新出现的去甲基化药物等治疗1 5 3 】。 2 1 支持治疗 无论对于低危还是高危M D S ，支持治疗均是所有治疗方案的基础。 支持治疗包括红细胞输注( 缓解贫血症状) 、血小板输注( 改善严重血小板 减少及其引起的出血) 、抗生素的应用( 对抗真菌、细菌、病毒感染)
16、 、祛铁治 疗( 缓解高铁负荷) 以及氨基己酸等抗纤溶药物的应用。对于血清C M V 阴性的 患者，应输注C M V 阴性的血制品；对于将来可能进行造血干细胞移植的患者， 应输注照射过的红细胞。支持治疗还包括临床各项指标的监测、心理情感上的 支持及生活质量的评估等。 2 2 低危M D S 患者的治疗 治疗策略：具有5 q 核型异常者应使用雷利度胺治疗；贫血患者根据血清E P O 水平进行分组：E P O 5 0 0 m U m l 、环形铁粒幼细胞 5 0 0m U m l 者， 可根据患者对免疫抑制治疗的敏感性采取免疫抑制治疗或去甲基化药物等治 疗。 2 2 1 造血刺激因子 天津医科大学博士学位论文综述 造血刺激因子包括E P O 、G C S F 、G M C S F 等单用或联合使用。一系列研究 结果显示，E P O 单用或与G C S F 联用治疗低危M D S 的总体反应率可达4 0 左 右【5 5 - 5
