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1、华中科技大学博士学位论文髓源及非髓源Toll样受体4在肝脏缺血再灌注期损伤中的作用姓名：王慧申请学位级别：博士专业：分子免疫学指导教师：李卓娅20070501华中科技大学博士学位论文华中科技大学博士学位论文3髓源及非髓源Toll样受体4在肝脏缺血再灌注期损伤中的作用摘要肝脏缺血再灌注(Ischemiaandreperfusion，IR)损伤的核心是过度的炎症反应。该损伤分为两个时相：I相主要为激活的枯否细胞(KupffercellKC)连同其分泌的细胞因子（如TNF-、IL-1等）引起的损伤；II相则是在KC，趋化性细胞因子、粘附分子等共同作用下，导致中性粒细胞(Polymorphnuclea
2、rleukocytePMN)趋化、黏附、聚集、活化所介导的损伤。后者是肝脏IR损伤的关键，其结果是肝细胞的坏死和凋亡，最终引起肝功能衰竭、甚至全身多脏器功能障碍综合征。Toll样受体4(Toll-likereceptor4，TLR4)是新近发现的启动机体急性炎症反应的受体，在天然免疫中起重要作用。通过该受体可诱导促炎细胞因子的产生，启动机体的炎症防御机制。已证明TLR4参与肝脏IR损伤。TLR4分布于肝窦内皮细胞(Liversinusoidalendotheliacells，LSEC)、KC及PMN，虽然肝细胞也表达TLR4，但一般认为该细胞的TLR4不参与肝脏IR损伤。有人证实在同一脏器组织
3、中，不同细胞表达的TLR4在急性炎症过程中的作用不同。用氯化钆阻断肝脏KC细胞功能后，虽然可减轻肝IR损伤，但是与假手术对照比较，仍有明显损伤，提示除KC外，其它细胞如PMN及LSEC表达的TLR4也可能参与启动肝脏IR的炎症过程。因此，本研究目的在于观察肝脏内不同细胞表面TLR4在肝IR损伤中的作用，阐明其通过招募、活化PMN而参与肝脏IRII期损伤的机制。一、骨髓移植小鼠模型的建立及鉴定一、骨髓移植小鼠模型的建立及鉴定将两种纯系雄鼠C3HHeJ(TLR4MutMut)及C3HHeN(TLR4+)的骨髓分别移植于同系雌鼠或交叉移植于相应品系的雌鼠，骨髓移植10周后，通过比较接受及未接受骨髓移
4、植小鼠的死亡率，用FISH和PCR检测受者的Y染色体及SRY基因，证实骨髓移植成功。故本研究获取了以下2种纯合体小鼠和2种嵌合体小鼠，为后续实验研究不同细胞表面TLR4在肝脏IR损伤中的作用奠定基础。华中科技大学博士学位论文华中科技大学博士学位论文4小鼠名称供体基因型受体基因型表型WTWTTLR4+TLR4+源细胞TLR4+非髓源细胞TLR4+MutMutTLR4MutMutTLR4MutMut源细胞TLR4MutMut非髓源细胞TLR4MutMutWTMutTLR4+TLR4MutMut源细胞TLR4+非髓源细胞TLR4MutMutMutWTTLR4MutMutTLR4+源细胞TLR4Mut
5、Mut非髓源细胞TLR4+二、比较髓源及非髓源细胞二、比较髓源及非髓源细胞TLR4在肝脏在肝脏IR期损伤中的作用期损伤中的作用用上述4种类型的小鼠建立肝脏部分缺血再灌注损伤动物模型。各组动物模型中门静脉血清无内毒素污染，外周血谷丙转氨酶(AlanineaminotransferaseALT)水平明显上升，HE及电镜显示肝细胞受损，炎性细胞浸润，且均在肝脏恢复灌注6-12小时最为显著。四组比较，在恢复灌注6小时及12小时，MutMut小鼠肝损伤最轻，而髓源细胞TLR4突变者组（MutWT）小鼠肝组织损伤较髓源细胞TLR4野生型组（WTMut）轻(P0.05不同组间、各组不同时间点之间没有显著性差
6、异三、动脉血清三、动脉血清ALT水平水平各组肝功能损伤酶学指标（外周血ALT水平）变化见于图8。在恢复灌注6h时最高，至12小时仍维持较高水平；四组比较，在恢复灌注6及12小时，WTWT组ALT水平最高，MutMut最低，WTMut组高于MutWT，除MutWT组与MutMut组在恢复灌注6小时差异无显著性外，其余组间差异均有显著性(P0.05，P#0.05)，提示TLR4，尤其是髓源性细胞表面有功能的TLR4对肝脏缺血再灌注损伤影响较大，而TLR4突变对肝脏缺血再灌注损伤有保护作用。P0.05为IR6h比较结果，P#0.05为IR12h比较结果图8各组小鼠动脉血清ALT水平讨讨论论肝脏细胞中
7、，骨髓来源的细胞包括枯否细胞，中性粒细胞，淋巴细胞，树突细胞等，更新速度较快，而占肝脏细胞绝大多数的肝细胞及肝窦内皮细胞均为非骨髓来源，更新速度很慢58。国外文献证实肝细胞表面虽然表达TLR4，但对LPS0500100015002000250030003500WTWTWTMutMutWTMutMutIUL0h3h6h12hP0.05P0.05P0.05P0.05P0.05华中科技大学博士学位论文华中科技大学博士学位论文49的刺激反应很弱。炎性介质刺激后，肝细胞TLR4的表达不上调2237。AllanTsung等认为在肝脏部分缺血再灌注损伤导致的无菌性炎症中，肝细胞TLR4不参与该过程22。我们
8、前期实验也证实肝细胞TLR4的表达在缺血再灌注损伤过程中无变化。内皮细胞在肝脏的非实质细胞中的比例约为50%，明显高于其他非实质细胞的比例，故推测肝脏非髓源细胞中发挥主要作用的细胞可能是内皮细胞。我们以第一部分中通过骨髓移植方法制备的“髓源细胞TLR4+和非髓源细胞TLR4MutMut”、“髓源细胞TLR4MutMut和非髓源细胞TLR4+”嵌合体小鼠及TLR4突变型、TLR4野生型纯合体小鼠为基础，制备肝脏IR期损伤，探索髓源细胞(KC、PMN)及非髓源细胞(LSEC，肝细胞)TLR4在其中发挥的作用。当使用小型动物建立全肝缺血再灌注模型时，经常同时伴随多种更为严重的病理过程，如严重的腹腔内
9、脏淤血、小肠缺血以及休克，这类动物往往不能耐受较长时间的缺血59。在本实验进行过程中，我们也对小鼠进行了全肝脏缺血再灌注的尝试。结果动物在常温下全肝脏缺血超过30minn死亡率达100%，缺血15min再灌注1h以内动物死亡率也达100%。为了深入研究肝脏缺血再灌注的发生发展机理，就需要排除各种伴随的病理生理过程对研究的干扰，因此我们采用了部分肝脏缺血再灌注损伤的动物模型。在此模型中，我们将支配肝脏左叶及中叶的门静脉及肝动脉血供均用无创血管夹夹闭以临时阻断血流，造成肝脏左叶及中叶的完全缺血。在长达1h的缺血过程中，无明显的腹腔内脏（尤其是小肠）淤血，因此，没有出现血清内毒素水平升高，而且在恢复
10、肝叶的血供后，内毒素水平亦未升高18。此外，造模时控制室温在37左右，以保证该模型为热缺血再灌注模型。热缺血再灌注损伤与肝脏外科、肝移植、低血容量性休克等普遍相关。预实验结果将该模型缺血时间确定为60分钟。缺血60分钟既可较好诱导肝脏损伤，也可保证良好肝脏灌注。而缺血时间小于60分钟仅仅引起轻微的转氨酶水平升高，缺血时间超过75分钟则常常导致再灌注不良，机体不能耐受。缺血1小时后，我们比较各组小鼠在恢复灌注0，3，6，12四个时间点的肝脏损伤差异。肝脏损伤以肝功能，肝脏大体及显微形态学改变等多方面指标作为衡量标准。我们的结果证实各组外周血ALT水平及肝脏病理性损伤均在恢复肝脏灌注6-12h时最
11、明显。已知华中科技大学博士学位论文华中科技大学博士学位论文50肝脏缺血再灌注损伤有明显的阶段分期：再灌注后2小时内称为早期，以氧化应激和释放活性氧物质直接导致肝细胞损伤为特征。肝脏再灌注2小时后至24小时为再灌注损伤晚期，是中性粒细胞聚集介导的炎症紊乱过程，同时也通过释放ROS损伤肝细胞112。故我们的研究与他人报道一致6061，随着再灌注时间延长，肝脏损伤较早期更加明显。四组小鼠比较，在恢复灌注6小时及12小时，TLR4MutMut(MutMut)小鼠肝损伤最轻，髓源细胞TLR4突变型(MutWT)组较“髓源细胞TLR4野生型者(WTMut组)轻，两组嵌合体小鼠ALT值均明显低于WTWT小鼠
12、。该结果提示如下几点：1.TLR4野生型纯合子较TLR4突变型纯合子而言，恢复灌注后损伤明显加重，提示TLR4参与肝脏缺血再灌注损伤，并在其晚期损伤中发挥重要作用。2.MutMut小鼠恢复灌注后几个时间点，肝转氨酶仅有轻度升高，大体形态学及超微形态学损伤均很轻微，提示TLR4突变造成的功能性缺失对缺血再灌注损伤具有保护作用。3.本实验首次提出，除髓源性细胞TLR4可影响肝脏IR损伤外，非髓源性细胞TLR4在该过程中所起的作用也不可忽视，因为恢复灌注12h，非髓源细胞TLR4野生型嵌合体(MutWT)的损伤明显大于TLR4MutMut纯合体(MutMut)。4.髓源细胞TLR4在其中作用更大，因
13、为髓源细胞TLR4野生嵌合组(WTMut)小鼠损伤明显比髓源细胞TLR4突变嵌合组(MutWT)重(P0.05)。髓源性细胞TLR4在炎症损伤中起重要作用并不令人惊奇，因其有重要的细胞学基础。首先，枯否细胞(KC)代表了体内最大的定居巨噬细胞群体，占总体定居巨噬细胞的80-90，肝脏的非实质细胞的40之多，再加上炎症过程中大量浸润的多形核细胞(PMN)，淋巴细胞，单核细胞等，髓源性细胞从数目上而言在肝脏占据着优势地位。其次，枯否细胞通过释放生物活性因子及影响肝脏微循环在肝脏缺血再灌注损伤中的作用至关重要。因此，髓源性细胞TLR4突变可减轻肝脏IR损伤。根据我们的结果，推测在肝脏IR的过程中，首
14、先由受损或坏死的细胞释放内源性配体，枯否细胞表面TLR4识别并结合这些配体而被激活，启动了TLR4下游的系列信号通路，导致炎症相关因子的产生，引起炎症反应和器官损伤316062。华中科技大学博士学位论文华中科技大学博士学位论文51此外，我们的结果提示髓源性细胞TLR4在肝脏缺血再灌注损伤发挥重要的作用，而PMN的聚集又是介导再灌注晚期损伤的重要细胞，二者之间有何联系？是如何相互作用的？迄今尚不清楚。我们将以不同的细胞为对象，在体内外研究PMN募集、渗出及活化与髓源和非髓源细胞TLR4在肝脏IR的相互关系及作用。华中科技大学博士学位论文华中科技大学博士学位论文52第三部分髓源细胞与非髓源细胞TL
15、R4参与肝脏IR期损伤的机制引言第三部分髓源细胞与非髓源细胞TLR4参与肝脏IR期损伤的机制引言第二部分中，我们证实髓源细胞TLR4及非髓源细胞TLR4均可影响肝脏IR期损伤，但髓源细胞TLR4作用更重要。由于PMN的一系列作用是肝脏IR期损伤发生的关键。PMN的趋化、活化、粘附，渗出等是PMN发挥效应的关键环节。本部分中，我们将用体内实验研究髓源细胞TLR4及非髓源细胞TLR4对上述环节中主要效应分子的影响，从而进一步揭示不同细胞表面TLR4参与肝脏IR期损伤的机制。材料与方法材料与方法一、氯化醋酸一、氯化醋酸AS-D萘酚酯酶染色萘酚酯酶染色(一一)材料材料1.主要试剂双蒸水，柠檬酸，萘酚A
16、S-D氯乙酸，FastredvioletLBbase，TRIZMALTM6.3Concentrate，亚硝酸钠，苏木素，丙酮，甲醛，盐酸，氯化钠2.主要仪器恒温水浴锅(武汉科学仪器厂)，显微镜(Nicon日本)3.试剂配置1)FastredvioletLBbase溶液：FastredvioletLBbase溶于0.4molL盐酸溶液中，使其终浓度为15mgml。2-8贮存。2)TRIZMALTM6.3ConcentrateTRIZMALmaleate25溶于双蒸水中，使其终浓度为1molL，调节pH值为6.3，2-8贮存。3)萘酚AS-D氯乙酸溶液华中科技大学博士学位论文华中科技大学博士学位论文53萘酚AS-D氯乙酸溶于双蒸水中，使其终浓度为8mgml，2-8贮存。4)亚硝酸钠溶液亚硝酸钠溶于双蒸水中，使其终浓度为0.1molL，2-8贮存。5)柠檬酸溶液柠檬酸，柠檬酸钠，氯化钠溶于双蒸水中，使其终浓度分别为18mmoll9mmoll12mmoll25调节pH值为3.62-
