《重组水蛭素ⅲ的分离纯化和鉴定》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重组水蛭素ⅲ的分离纯化和鉴定（9页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、研究论文综述 2 0 0 4 年全田生物技术学术研讨会论文集 重组水蛭素I 的分离纯化和鉴定 韦利军1昊斌2 李雪峰1 叶双宁1 章良1昊梧桐 ( 1 中国药科大学生命科学与技术学院；2 常州千红生化制药公司) 摘要：对大肠杆菌生产的重组水蛭素l l l 发酵液进行三个步骤的纯化，选出最佳分离纯化条 件。首先将分泌到培养基上清液中的水蛭素进行大孔吸附树脂层析，再用D E A E 纤维素离子交 换层析分离，最后用制备型反相高效液相色谱层析，经真空冷冻干燥得到水蛭素成品。对收集 液进行S D S P A G E 分析，各步纯化产物均达到电泳纯】o o ；经分析型反相高效液相色谱分析， 成品纯度大于
2、反相纯9 5 ：经质谱鉴定，成品分子量约为6 9 2 0 ，确为重组水蛭素l l I 。 关t 词。水蛭素，分离，纯化，大孔吸附树脂，反相高效液相色谱，质谱 水蛭素是蛭类动物唾液腺分泌的一种酸性多肽。人类利用水蛭治病的历史可追溯到远古时 代。基因重组水蛭素( R e c o m b i n a n tH i r u d i n ) 是天然水蛭素的基因重组产物，但在酪6 3 无硫酸 基，故亦称为去硫酸水蛭素。重组水蛭素和天然水蛭素一样，是典型的抗凝血酶药。水蛭素存 在十种以上变异体I ，现已分离鉴定出7 种异构体1 2 1 ，主要的三种称为H V I ，H V 2 和H V 3 。吸 血水蛭的水
3、蛭素含量极少，从水蛭中大量提取水蛭素是不可能的。生物技术的飞速发展，为大 量生产水蛭素开辟了广阔的前景。H V 3的氨基酸序列如下所示： I T Y T D C T E S G Q N L C L C E G S N V C G K G N K C I L G S N G K G N Q C V T G E G T P K P Q S H N Q G D F E P I P E D A Y D E I 引。谭树华博士于1 9 9 7 年合成了重组水蛭素H V 3 基因，并通过L 天门冬酰氨酶l l 信号序列 在大肠杆菌中分泌表达f 4 1 。本文试图摸索出重组水蛭素I I I 的分离纯化优化组
4、合与条件，并对纯 化产物进行鉴定。 l 材料与方法 1 , 1 材料 重组水蛭素l I I 发酵液由本实验室提供；M i t s u b i s s h i 公司大孔吸附树脂H P 2 0 ，S P 7 0 和S P 2 0 7 ： 美国W h a t m a n 的D E A E c e l l u l o s eD E 5 2 ；美国T e d i a 公司产色谱纯乙腈；其它试剂为分析纯。 A K T AE x p l o r e 喇液相色谱仪。反相柱R E S O U R C E1 5R P C ；Z O R B A X 大孔3 0 0 反相S t a b l e b o n d H P
5、 L C 。 Q T O F m i c r o T MM S M S 型质谱仪。 1 2 抗凝血奠活力的测定 水蛭素生物活性的测定参照M a r k w a r d t 的凝血酶滴定方法进行【5 】。于酶标板小孔中加2 0 0 p i O 5 牛血纤维蛋白原( 0 0 5 m o l L T r i s - H C I 缓冲液( p H 7 4 ) 配制) 。再加入1 0 1 0 0 1 _ L i 水蛭素溶液， 充分混匀。用微量进样器吸取标准的凝血酶溶液( 1 0 0 N I H 单位) ，时间间隔为1 r a i n ，若在1 m i n 内纤维蛋白原发生凝固，即说明已达滴定终点。由凝血
6、酶的消耗量换算出水蛭素的单位数。由 于水蛭素与凝血酶是1 ：1 结合，故每消耗一个凝血酶单位( N I H ) 相当于个抗凝血酶单位( A T U ) 。 1 3 大孔树脂层析分离纯化 1 3 1 静态吸附实验 l 2 0 0 4 年全国生物技术学术研讨会论文集 研究论文综述 室温下将2 m l 湿树脂置于2 5 m i 摇瓶中，加入发酵液5 m l ，上恒温摇床振荡，1 0 m i n 后测定 上清中抗凝血酶活力，计算每种树脂一定时间内的吸附率。 吸附率 E ( ) = 旦等 1 0 0 。式中c 。，c 分别为吸附前后单位体积内的抗凝活力 ( A T U m 1 ) 。 发酵液调P H 值
7、3 ，4 ，5 ，6 和7 ，2 m l 湿树脂装入2 5 m l 摇瓶，分别加入上述5 种溶液2 0 m i ， 恒温摇床振荡( 1 2 0 r p m ) ，每3 0 m i n 取上清O 5 m i n 离心测活，选择最佳p H 值。 1 3 2 动态吸附实验 一定体积的发酵液上1 0 m l 湿树脂柱，用恒流泵调节流速，流出液出现抗凝血酶活力即停止 上样，测定发酵液的剩余体积，根据公式( V 1 - v 2 ) X A v 计算出树脂的吸附量。式中v l 表示发 酵液初体积，v 2 表示发酵液终体积，A 表示发酵液的抗凝血酶活力，V 表示湿树脂的体积。 取1 0 m l 湿树脂装柱，将
8、2 0 0 m l 发酵液用恒流泵反向循环泵入柱体，流速为1 m l m i n ，每隔 3 0 m i n 测定吸附率( ) ，绘制动态吸附曲线。 1 3 3 解析与洗脱 室温下，将大孔吸附树脂装柱，用2 0 m m o l L 乙酸平衡，调节发酵上清液p H 值至最佳p H 值，以l m l m i n 的流速，将样品上柱。用酸( 2 0 m m o l L 乙酸) 、碱( 5 0 m m o i Lt r i s H C l ) 清洗， 采用不同的溶液作为洗脱剂进行洗脱，收集活性组分，测定洗脱曲线，并计算回收率。 1 4 离子交换纤维素层析分离纯化 1 0 m lD E A E c e
9、l l u l o s eD E 5 2 装柱，用2 0 m m o l L 哌嗪( p H 6 0 ) 平衡，调节大孔树脂纯化液 p H 6 0 后上样，用平衡缓冲液洗涤至基线平稳，再用含0 - 0 5 m o l L N a C I 的2 0 m m o l L 哌嗪( p H 6 0 ) 溶液梯度洗脱，收集活性组分。 1 5 制各型反相高效液相色谱分离纯化 选择不同组分作为流动相【6 7 l ，于相同条件下在液相色谱仪上进行反相高效液相层析。条件 如下： 1 ) A 液0 1 ( v v ) F T Ai n l 0 0 ( ) 水；B 液0 1 ( v v ) F T Ai n1 0
10、0 ( v v ) 异丙醇。2 ) A 液0 1 ( v v ) F T Ai n1 0 0 ( ) 水；B 液0 1 ( v v ) F T Ai n1 0 0 ( v v ) 乙腈。色谱柱：r e s o u r c e T M 1 5 R P C ，柱温为室温，流速2 m l m i n ，洗脱梯度：0 1 0 0 异丙醇，1 5 - 5 0 乙腈。 1 6 重组水蛭素的分离纯化组合实验 采用优化后的分离纯化条件对水蛭素I l l 发酵液进行放大分离纯化实验。大孔吸附树脂装 5 c m X 4 0 c m 柱，用酸( 2 0 m m o l L 乙酸) 、碱( 5 0 m m o l L
11、 t r i s P r l C l ) 清洗，洗脱剂洗脱，收集有抗 凝血酶活性的洗脱峰。D E A E 纤维紊装5 c m X 4 0 c m 柱，大孔树脂层析的活性部分上柱，用平衡缓 冲液洗涤至基线平稳，以2 0 m m o l L 哌嗪( p H 6 O ) 含0 - 0 5 m o l L N a C l 线性梯度洗脱，收集抗凝活 性部分。反相R E S O U R C E1 5R P C 柱，取D E A E 柱活性部分上样。洗脱剂洗脱，收集洗脱液， 真空冷冻干燥。 1 7 水蛭素的鉴定 1 7 1 蛋白质浓度测定 按照L o w r y 法测定。配置标准蛋白溶液，制作标准曲线，测定
12、发酵液及纯化各步骤所得样 品中蛋白质含量。 1 7 2 蛋白质变性( S D S ) 不连续凝胶电泳【s 】 1 0 S 研究论文综述2 0 0 4 年全田生物技术学术研讨会论文集 以中分子量M a r k e r 为分子量为对照，对发酵上清液及各纯化步骤所得样品进行S D S - P A G E ， 考马斯亮蓝染色后观察并分析。 1 7 3 分析型反相高效液相鉴定 将制备型反相高效液相色谱纯化样品送南京大学医药生物技术国家重点实验室进行分析型 反相高效液相色谱鉴定其纯度。 1 7 4 质谱鉴定 将制备型反相高效液相色谱纯化样品进行Q T O Fm i c r oM S M S 质谱分析。 2
13、 结果 2 1 重组水蛭如的分离纯纯 2 1 1 静态吸附实验 2 1 1 1 树脂的筛选 选择三种树脂( H P 2 0 ，S P 7 0 ，S P 2 0 7 ) ，观察其静态吸附率，见图1 。 装9 0 g8 5 e8 0 o 们 号7 5 o7 0 盘6 5 F i g1A b s o r p t i o no fd i f f e r e n tr e s i n s 实验结果表明，三种树脂对重组水蛭素I I I 的静态吸附能力依次为：H P 2 0 S P 2 0 7 S P 7 0 。故 选择H P 2 0 树脂作为最佳，进行以下实验。 2 1 1 2 最佳p H 值的选择 不同
14、p H 值的发酵液在H P 2 0 树脂中的吸附曲线见图2 。 1 0 6 01 0 02 0 03 0 0 4 0 05 0 0 T i m e r a i n + 3 + 4 5 一* 一6 卜7 2A b s o r p t i o no f r - h i r u d i ni nc u l t u r e so f d i f f e r e n tp H 扣 们 O 叠篁。州-AIo点时ko_曙配 2 0 0 4 年全田生物技术学术研讨会论文集 研究论文综述 虽然p H 4 的吸附率高，但由于r - h i r u d i n 3 的等电点为4 1 7 8 ，在p H 4 时发酵液
15、出现明显的沉 淀，因而卜h i r u d i n 3 在发酵液上清里的浓度减小，检测时吸附率偏高。故选择p H 5 为上样最佳 p H 值。 2 1 2 动态吸附实验 2 1 2 1 流速对吸附量的影响 发酵液调p H 5 0 后上1 0 m l 湿树脂柱，观察不同流速下H P 2 0 树脂的吸附量，结果见图3 。 Ol234 F l o wr a t e m l m i n F i g3A b s o r p t i o no fr - h i r u d i n 3b yd i f f e r e n tf l o wr a t e 由图3 可以看出流速在0 5 m l m i n 时H
16、 P 2 0 的吸附量大于流速为1 m l m i n 时的，但并不显著， 而且流速太慢增加了样品在柱上的时间，增大了r - h i r u d i n 3 的变性可能性，所以选择流速在 l m l m i n 为最佳流速进行分离。 2 1 2 2 动态吸附曲线 取l O m l 湿树脂装柱，将2 0 0 m l 发酵液用恒流泵反向循环泵入柱体，流速为l m l m i n ，每隔 3 0 r a i n 测定吸附率，见图4 。 1 0 0 2 T i l e r a i n ，1 一A b s o r p t i o no fr - h i r u d i n 3 从图4 可以看出，在上柱发酵液与湿树脂体积为2 0 ：l 的情况下，2 1 0 r a i n 后吸附达到平衡， 吸附速率相对较快 2
