《重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白ⅲ发酵条件优化与分离纯化研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白ⅲ发酵条件优化与分离纯化研究（65页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、西北大学 硕士学位论文 重组大肠杆菌生产类人胶原蛋白发酵条件优化与分离纯化研 究 姓名：张驰 申请学位级别：硕士 专业：微生物学 指导教师：范代娣 20090611 重组大肠杆菌发酵生产类人胶原蛋白I I I 发酵条件优化及分离纯化研究 手葡姜 为了提高类人胶原蛋白H I ( h u m a n 1 i k ec o l l a g e nI I I ，简称H L CI I I ) 产量，本研究主 要从培养基、发酵过程参数、补料方式和分离纯化等方面出发对重组大肠杆菌发酵生产 H L C1 1 1 进行了优化。 培养基优化，采用摇瓶培养的方式利用响应面法进行优化。首先通过单因素实验从 葡萄糖、甘
2、油和蔗糖中筛选出葡萄糖甘油质量比为1 ：4 的混合碳源，从硫酸铵、氯化铵、 硝酸铵和硝酸钠中筛选出硫酸铵与酵母粉共同作为培养基的氮源。再采用 P l a c k e t t B u r m a n 设计从混合碳源、硫酸铵、酵母粉、硫酸镁、E D T A 、磷酸盐、氯化钙 和微量元素中筛选出对H L CI I I 产量影响显著的三个因素即混合碳源、硫酸铵和酵母粉。 然后，采用最陡爬坡实验逼近最佳值区域，以在后续实验中建立有效的响应面方程。通 过响应面法的B o x 。B e h n k e n 设计实验，得到高度模拟实际实验的回归方程，并由此获得 了三个显著影响因素的最佳取值( 混合碳源1 2
3、2 4 9 i n ，硫酸铵7 1 2 9 L ，酵母粉5 5 3 9 ) ， 所对应的H L C1 1 1 产量的预测最高值为6 0 5 9 L 。验证试验结果显示在发酵罐中利用优化 后的培养基可使H L CI I I 产量达到6 1 2 9 L ，较优化前提高了将近三倍。 对于发酵过程参数优化同样采用响应面法，采用1 2 8 L 发酵罐培养的方式进行试验。 首先采用P l a c k e t t B u r m a n 设计从接种量、诱导时间、接种龄、装液量、罐压、空气流量、 p H 和溶氧8 个发酵参数中筛选出对H L CI l i 产量影响显著的三个因素，即诱导时间、 接种龄和p H
4、。然后采用最陡爬坡实验法逼近最佳值区域，利用响应面法求出这三个因 素的最佳取值( 诱导时间3 3 h ，接种龄1 3 h 和p H7 O ) ，并获得最高H L CH I 产量( 9 8 7 9 L ) 。 验证试验表明，采用优化后的发酵过程参数能够使H L CI I I 产量达到9 6 8 L ，较优化前 提高了约6 0 。 在补料控制策略方面，实验中考察了不同补糖方式( 连续流加补糖和间歇补糖) 、 不同补氮方式( 连续流加补氮和间歇补氮) 、不同比生长速率( O 0 5 0 1 h t , 0 1 4 ) 1 5 h l , 0 1 5 o 2h - t , 0 2 o 2 5 1 )
5、对于菌体和H L CI I I 的影响。结果表明，连续流 加补糖、连续流加补氮和控制比生长速率为0 1 0 1 5 h 。是较优的补料控制策略。 在H L CI I I 的分离纯化中，先对发酵液进预处理获得总蛋白溶液。再用正交试验设 计法确定沉淀步骤中的加盐量为3 、p H 为4 。然后通过透析除盐、阳离子离子交换后 获得了高纯度的H L CI I I ，纯度达到9 3 0 1 。 关键词：类人胶原蛋白I I I ：重组大肠杆菌；培养基优化；发酵过程参数优化：分离纯化。 A b s t r a c t F e r m e n t a t i o nm e d i u mo p t i m i
6、z a t i o n ，p r o c e s sp a r a m e t e r so p t i m i z a t i o n ，f e e d i n gs t r a t e g y ， s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fh u m a n l i k ec o l l a g e nI I Ip r o d u c e db yr e c o m b i n a n tE s c h e r i c h i a c o l iw e r er e s e a r c h e di nt h i sp a p e
7、r R e s p o n s es u r f a c em e t h o d o l o g yw a se m p l o y e dt oo p t i m i z et h ef e r m e n t a t i o nm e d i u ma n d p r o c e s sp a r a m e t e r s I nt h es t a g eo fm e d i u mo p t i m i z a t i o n ，m i x e dc a r b o ns o u r c e ( m a s sr a t i oo f g l u c o s ea n dg l y
8、 c e r o lw a s1 ：4 ) a n dn i t r o g e ns o u r c e ( y e a s tp o w d e ra n da m m o n i u ms u l f a t e ) w e r es c r e e a e da sm o s tt h es u i t a b l ec a r b o na n dn i t r o g e ns o u r c ei nt h es i n g l ef a c t o rs c r e e n i n g e x p e r i m e n t s P l a c k e t t - B u r
9、m a nd e s i g nW a sa p p l i e dt oe v a l u a t et h ee f f e c t so fe i g h tm e d i u m c o m p o n e n t s ( m i x e dc a r b o ns o u r c e ，y e a s tp o w d e r , a m m o n i u ms u l f a t e ，m a g n e s i u ms u l f a t e ， E D T A ，p h o s p h a t eb u f f e r , c a l c i u mc h l o r i
10、d ea n dt r a c ee l e m e n t s ) o n t h ep r o d u c t i o no fH L CI I I ， w h i c hs h o w e dt h a tm i x e dc a r b o ns o u r c e ，y e a s tp o w d e ra n da m m o n i u ms u l f a t ew e r et h em o s t s i g n i f i c a n ti n g r e d i e n t s ( P 0 0 5 ，表明失拟不显著，回归显著；因素x 2 和x 3 对H L C I I
11、 I 产量的线性效应显著；X 1 X 2 ，x l x 3 ，x 2 X 3 对H L CI I I 产量的交互效应影响显著，其曲面 效应亦显著【7 - 8 】。， ， 根据回归方程利用M i n i t a b l 5 0 对回归方程绘出响应面分析图及其等高线，见图 3 4 3 6 。每个响应面分别代表、两个独立变量之间的相互作用对H L CI I I 产量的影响，第 三个独立变量的保持值为中心值。 6 m C m5 l 图3 4 混合碳源和硫酸铵对类人胶原蛋白产量的响应面分析图和等值线图 F i g u r e3 4 R e s p o n s es u r f a c ep l o ta
12、 n dc o n t o u rp l o to f t h ee f f e c t so fm i x e dc a r b o n r e s o u r c ea n da m m o n i u ms u l f a t eo nH L CI I Iy i e l d 3 5 第三章发酵培养摹的优化 6 H L c 5 J I 6 0 5 醇母粉 窦 岔 魏 6 ，0 6 2 6 46 ，66S - 07 27 4 一6 磕酸铰 图3 5 混合碳源和酵母粉对类人胶原蛋白产量的响应面分析图和等值线图 F i g u r e3 5R e s p o n s es u r f a c e
13、p l o ta n dc o n t o u rp l o to ft h ee f f e c t so fm i x e dc a r b o n r e s o u r c ea n dy e a s tp o w d e ro nH L C y i e l d 6 H L c 5 4 3 图3 6 酵母粉和硫酸铵对类人胶原蛋白产量的响应面分析图和等值线图 F i g u r e3 6R e s p o n s es u r f a c ep l o ta n dc o n t o u rp l o to ft h ee f f e c t so fy e a s tp o w d e
14、 ra n d a m m o n i u ms u l f a t eo nc o l l a g e ny i e l d 从以上三图可以直观地看出混合碳源、硫酸铵和酵母粉各自的水平以及相互作用对H L C I I I 产量的影响。通过分析响应曲面并对回归方程( 3 4 ) 求偏导，得到三种因素的最佳取值为 X I 一0 0 0 7 8 ，x 2 = 0 4 0 1 1 ，x 3 = 0 4 1 6 2 ，对应的实际值分别为葡萄糖甘油( 1 ：4 ) 混合碳源1 2 2 4 9 L ， 硫酸铵7 1 2 L ，酵母粉5 5 3 9 i 。对应的H L CI I I 的理论最佳产量Y 为6
15、0 5 9 L 。由图3 4 可以看出， 当混合碳源浓度在1 1 1 2 2 4 9 L 时，随着浓度增加，茵体获得充足的碳源，目标蛋白表达量呈 上升趋势，但当混合碳源浓度在1 2 2 4 1 3 5 0 9 L 时，随着浓度的增加目标蛋白表达量呈下降 趋势。这可能是由于过量碳源产生的反馈调节或产生的乙酸阻碍了目标蛋白的表达；乙酸被 认为是H + A T P 泵的解偶联剂，使质子泵驱动力下降，从而影响A T P 的合成【9 】。此外，糖量过 多造成细胞生长过旺，供氧不足【1 0 】。从图3 5 可以看出，酵母粉和硫酸铵分别在6 、7 1 2 9 m 矛n 4 4 - - 5 5 3 9 m 时
16、目标蛋白产量呈上升趋势，这是因为酵母粉和硫酸铵浓度的增加满足了目标蛋 白表达所需的氮源，而当这两种物质的量超过最优点时会因为反馈调节和离子浓度过高、渗 西北大学硕士学位论文 透压增大等原因导致目标蛋白表达量下降。 3 3 验证试验 分别在三角瓶和1 2 8 L 发酵罐中对上述模型得出的最佳培养基配比进行验证试验，同时以未t I i 化的培养基作对照，得到的产量见表3 9 。可见该模型可以对实际发酵情况进行较好地模拟， 优化效果明显。 表3 9 培养基优化前与优化后的H L CI I I 产量 T a b l e3 9H L Cl I Iy i e l d su n d e ru n o p t i m i z a t i o na n do p t i m i z a t i o n 3 4 结果讨论 ( 1 ) 使用葡萄糖作为碳源可以使大肠杆菌迅速生长，但很容易产生副产物乙酸，引起菌
