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1、博博 士士 学学 位位 论论 文文 颈双缘姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究 颈双缘姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究 作作 者者 姓姓 名名 郦 卫 弟 郦 卫 弟 指指 导导 教教 师师 陈 学 新 教 授陈 学 新 教 授 学科、专业学科、专业 农业昆虫与害虫防治 农业昆虫与害虫防治 所所 在在 学学 院院 农业与生物技术学院农业与生物技术学院 提提 交交 日日 期期 2005 年年 11 月月 中国中国. 杭州 杭州 浙江大学博士学位论文：颈双缘姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究 II 单 位 代 码 1 0 3 3 5 研究生学号 10216025 博博 士士 学学 位位 论论 文文 颈双
2、缘姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究颈双缘姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究 答辩委员会主席答辩委员会主席： 论论 文文 评评 阅阅 人人： 论文答辩日期论文答辩日期： 浙江大学博士学位论文：颈双缘姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究 III PHYSIOLOGICAL REGULATION MECHANISMS OF DIADROMUS COLLARIS(GRAVENHORST) (HYMENOPTERA: ICHNEUMONIDAE )ON ITS HOST DIAMONDBACK MOTH, PLUTELLA XYLOSTELLA (LINNAEUS)(LEPIDOPTERA: PLUTELLI
3、DAE) A Dissertation Submitted as Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Doctor with Major in Agricultural Entomology and Insect Pest Control in Zhejiang University Ph.D Candidate: Wei-di LI Supervisor: Prof. Xue-xin CHEN November 2005 Hangzhou 310029 Zhejiang, China 浙江大学博士学位论文：颈双缘
4、姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究 IV 本论文研究得到 国家自然科学基金重点项目（编号：30370959） 教育部“新世纪优秀人才支持计划”（编号： NCET-04-0521） 的资助 浙江大学博士学位论文：颈双缘姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究 I 致致 谢谢 本论文是在导师陈学新教授的悉心指导下完成的。导师学识渊博，治学严谨，待人诚恳，为人 正直，更以他敏锐的学术思想深深影响着我，激励我不断进取。从实验设计直至论文写作的每一个 环节，都凝聚着导师大量的心血和汗水。值此论文完成之际，谨向他表达我最诚挚的谢意和崇高的 敬意。 在研究过程中，本所的何俊华教授以其渊博的学识，严谨的治学态度，热情、
5、耐心、细致地为 我答疑解惑，令我非常钦佩和感动；程家安教授、胡萃教授、刘树生教授、叶恭银教授、张传溪教 授、施祖华教授和徐志宏教授对本实验提出了许多宝贵的意见；刘银泉副教授和姚洪渭副教授为本 实验提供了部分研究材料和实验条件，确保了实验的顺利进行；娄永根教授、莫建初教授、祝增荣 研究员、余虹副教授和蒋明星教授给予了热心指点和帮助；唐启义研究员提供的 DPS 数据统计与分 析软件为本论文的数据分析提供了极大的便利，并取得了满意的结果；马云老师在学习和生活上都 给予了我很多鼓励和帮助；农业与生物技术学院植保系和研究生科许多老师为我提供了学习和生活 上的关心和照顾。在此，向他们致以最衷心的感谢！ 动
6、物科学学院蚕学分子实验室的钟伯雄教授为本研究提供了显微注射， 并亲自指导和解答难题， 令我非常感动；测试中心的洪健教授、徐颖教授和黎军英、方月鲜等老师在电镜样品的制备过程中 提供了很大帮助；核农所孙志明老师热情帮助辐射处理寄生蜂。在此，致以我最诚挚的谢意。 另外在研究工作中，本实验的白素芬博士和潘健硕士在研究思路上和实验过程中给予热情帮助 和指点，本论文的完成也离不开其它许多同学的帮助，他们是本实验室的朴美花博士后、时敏博士 后、戴仁怀博士、王义平副教授、李芳芳、黄芳和陈亚锋，郎法勇硕士、尹承山硕士、余晓霞硕士、 万志伟硕士、吴琼硕士、汪海燕、狄蕊、徐鹏、俞瑞鲜、吴国艳硕士和王会美硕士。另外还
7、有分子 实验室的王芳博士后，李江红博士；生理生化实验室的蒋彩英博士、张忠博士、姚鹏程硕士、李凯、 石宇、黄诚华和朱家颖；生态实验室的吴志毅博士生等。另外还有杜彩裕小姐在各方面的帮助。本 实验和论文得以顺利完成，离不开老师、同学和朋友们的支持、鼓励和帮助。在此，向他们表示我 最真诚的谢意！ 几年来，父母亲及公公婆婆不顾多病的身体为我含辛茹苦抚养年幼的孩子，使我安心学业。在 此，向他们表达我深深的感激之情！特别要感谢我的爱人魏方林先生，一直以来给予我的理解、鼓 励和照顾，他为本研究的顺利进行付出了辛勤的劳动。 再次，向所有关心和帮助我的人表示深深的谢意！ 郦卫弟 2005-11 浙江大学博士学位论
8、文：颈双缘姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究 II 中文摘要中文摘要 本文对十字花科蔬菜重要害虫小菜蛾 Plutella xylostella (Linnaeus)蛹的优势种 寄生蜂颈双缘姬蜂 Diadromus collaris(Gravenhorst)对寄主的生理调控机制进行了研究， 初步了解了寄生及毒液在其中的作用。取得了以下结果： 一、颈双缘姬蜂雌性生殖系统观察及毒液器官超微结构一、颈双缘姬蜂雌性生殖系统观察及毒液器官超微结构 通过透射电镜观察，颈双缘姬蜂卵巢液流内不含病毒颗粒。通过光学显微镜观察， 卵巢组织不含卵萼区，毒液器官由一个囊状的毒液囊及其顶上两根线状的毒液腺组成， 毒液通过一
9、根小导管从毒液囊流入输卵管。 对毒液腺横切面超薄切片的透射电镜观察发现，毒液腺组织由内到外依次是由毒液 腺腔、围绕腺腔的几丁质层、导管细胞、分泌细胞和基膜组成。分泌细胞结构复杂，是 组成腺体的主要部分，它内含丰富的电子密度的分泌性小囊、各种细胞器、一个辐射状 结构的末端细胞器和其相连的角质状导管， 通过它们将分泌性小囊中的毒蛋白输送到腺 腔中。通过对不同年龄阶段的毒腺结构观察，发现这些分泌细胞有一个发生、成熟和衰 老的过程。 通过对毒液囊横切面的透射电镜观察发现， 囊壁由内到外依次是由围绕囊腔腔的几 丁质层、细胞层、肌肉层和基膜组成。毒液囊壁的细胞层结构分为两种类型，一种是具 有分泌细胞和导管
10、细胞结构的分泌性单元组成，另一种由上皮细胞组成。囊壁的分泌性 单元相似于毒液腺管部分的分泌性单元，但结构比后者要简单。毒液囊的细胞结构也表 现出与毒液细胞相同的变化规律。 二、颈双缘姬蜂毒液蛋白生化特性及抗菌活性二、颈双缘姬蜂毒液蛋白生化特性及抗菌活性 颈双缘姬蜂每个毒液囊的蛋白含量为 0.4g， 毒液蛋白的分子量范围为 8-75kDa， 其 中 32.5、28.2、25.1 和 9kDa 的多肽含量较高。通过糖蛋白染色发现，毒液中含有极微 量的糖蛋白， 分子量为 75kDa。 毒液具有抗埃希大肠杆菌的活性， 在细菌的平板培养时， 当毒液量为 20 个毒液囊量时， 细菌的生长被完全抑制， 当毒
11、液量为 10 个毒液囊的量时， 细菌的生长被部分抑制，而当毒液用量为 2 个毒液囊当量时细菌的生长不受影响。通过 液体培养的毒液抗细菌活性分析得出，毒液对细菌的最低生长抑制浓度(MIC)为 0.2-0.8g/l。 浙江大学博士学位论文：颈双缘姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究 III 三、颈双缘姬蜂寄生及假寄生对小菜蛾蛹免疫因子的影响三、颈双缘姬蜂寄生及假寄生对小菜蛾蛹免疫因子的影响 寄生及假寄生能引起寄主总血细胞及两种主要类型血细胞(浆血细胞和颗粒血细胞) 数量的大量上升，寄生还能引起颗粒血细胞和浆血细胞延展行为的抑制。假寄生抑制了 小菜蛾蛹血淋巴的酚氧化酶活性和蛹血淋巴对 Sephadex
12、G-100 珠子的包囊。 假寄生引起 小菜蛾蛹对真菌(绿僵菌)的感染率增加。 四、颈双缘姬蜂毒液对小菜蛾幼虫免疫因子的影响四、颈双缘姬蜂毒液对小菜蛾幼虫免疫因子的影响 0.04VRE/l 的毒液对小菜蛾幼虫血细胞延展行为和活性产生影响。 毒液能明显地抑 制浆血细胞的延展，对颗粒血细胞的延展也有一定的影响。毒液与血细胞共同孵育 3h 后，对照颗粒血细胞延展率为 991%，而加毒液处理组则下降至 503%；毒液对小菜蛾 浆血细胞延展率的抑制更明显，使它下降至 5%。毒液同样对浆血细胞和颗粒血细胞的 活性产生明显的影响。当血细胞孵育 3h 后再加入毒液，在孵育 3 小时后观察，颗粒血 细胞从对照未加
13、毒液处理的 991%下降至 503%， 对浆血细胞存活率的抑制更明显， 使 它下降至 201%。通过毒液对血细胞毒性的分析发现，毒液与血细胞共同孵育 3.5h 后， 血细胞出现空泡的症状。 另外， 毒液抑制了小菜蛾幼虫血淋巴在体外对 L多巴的黑化， 但是随着时间的推移与对照的差异不明显。 毒液抑制了小菜蛾幼虫血细胞在体外对埃希大肠杆菌的吞噬。400、80 或 4ng/l 毒 液的处理，使参与吞噬反应的血细胞分别比对照降低了 755%，308%和 102%。毒液 通过影响血细胞的活性而抑制了对大肠杆菌的吞噬。 五、颈双缘姬蜂毒液对非适合寄主幼虫活性免疫因子的影响五、颈双缘姬蜂毒液对非适合寄主幼虫
14、活性免疫因子的影响 0.04VRE/l 毒液对菜青虫菜粉蝶幼虫和玉米螟幼虫的血细胞延展率没有影响， 与对 照相近。毒液对菜青虫菜粉蝶幼虫血细胞的存活率产生影响，浆血细胞和颗粒血细胞的 存活率分别为 734%和 652%， 而对玉米螟幼虫的血细胞存活率没有影响。 毒液对菜粉 蝶幼虫血淋巴体外黑化能力有一定的抑制， 对玉米螟幼虫血淋巴的体外黑化能力没有影 响。 六、颈双缘姬蜂寄生及假寄生对小菜蛾蛹营养状态的影响六、颈双缘姬蜂寄生及假寄生对小菜蛾蛹营养状态的影响 寄生和假寄生引起小菜蛾蛹脂肪体内脂类和蛋白浓度下降，同时由于幼蜂的取食， 寄生处理的小菜蛾蛹寄生后1.5天开始脂肪体内脂类和蛋白浓度的下降
15、更多。 假寄生使小 浙江大学博士学位论文：颈双缘姬蜂调控寄主小菜蛾的生理机制研究 IV 菜蛾蛹血淋巴脂含量比对照要高，寄生处理在前期血淋巴脂浓度与假寄生处理相近，从 寄生后2天开始，由于幼蜂的取食，血淋巴脂浓度比对照要低；血淋巴蛋白浓度假寄生 与对照相近，寄生处理在前期血淋巴蛋白浓度与假寄生处理相近，从寄生后2天开始， 由于幼蜂取食，血淋巴蛋白浓度比对照要低。 幼蜂在刚孵化时脂浓度处于较低的水平， 随后逐渐增高， 至寄生后 3.5d 时有一个较 大的增长量，至 5.5d 时增加更快。 七、颈双缘姬蜂寄生及假寄生对小菜蛾蛹脂肪体组织结构的影响七、颈双缘姬蜂寄生及假寄生对小菜蛾蛹脂肪体组织结构的影
16、响 从脂肪体光学形态的观察来看，假寄生与寄生后，脂肪组织从外周开始松散，脂肪 细胞分散到寄主的血腔中， 寄生后这种现象更明显。 从脂肪体的半薄切片来看， 寄生后， ， 而外周的脂肪体细胞的着色较浅，细胞内含物少，细胞内呈现出空洞。被假寄生的蛹脂 肪体细胞的着色位于两者之间。 从透射电镜下观察发现， 寄生后的脂肪体细胞间隙增大， 细胞内蛋白颗粒数量减少，且着色深浅不一，同时脂滴数量也减少。寄生加速脂肪体细 胞的自噬分解过程，很多蛋白颗粒内的贮存物质被自噬体分解成细小的颗粒。细胞膜上 出现一些被溶解的缺口， 脂肪体细胞的贮存物质一部分通过被分解的细小的颗粒的形式 被分泌出来，另一部分以大的颗粒通过细胞膜的裂口直接游离到血淋巴。被假寄生的小 菜蛾蛹内脂肪体细胞内颗粒被分解的程度要低于被寄生的小菜蛾蛹。 毒液中含有能分解 细胞膜的透明质酸酶及磷脂酶 A2和 B 的活性。 八、八、 颈双缘姬蜂寄生及假寄生对小菜蛾蛹行为和发育的影响颈双缘姬蜂寄生及假寄生对小菜蛾
