《生物工程下游技术第十一章_无机基质高效色谱填料解析》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物工程下游技术第十一章_无机基质高效色谱填料解析（53页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、第十一章 无机基质高效色谱填料 微孔型 大孔型 微孔微孔 薄膜型 表面多孔型 离子交换层 惰性核惰性核 离子交换剂硅胶层涂覆 HPLC中常用的几种微粒类型 硅胶 可控孔径玻璃 其它：氧化铝、氧化锆、氧化钛、 碳和石墨微球。 制备:制成适宜的球形或无定形颗粒 ,化学键合或涂层法改性。 第一节 无机基质 一.硅胶: 表面含丰富硅醇基或硅羟基, 可化学键合或改性; 表面存在大量物理吸附水,增加处理或修饰复杂性 。 1.化学性质:多孔二氧化硅 化学性质稳定,pH适应范围1-9，安全pH范围为2-8 。 晶型二氧化硅表面可能仅有自由硅羟基； 无定形硅胶则有自由硅羟基、邻位硅羟基、氢键 结合水或物理吸附水
2、。 HPLC硅胶担体的表面 物理吸附水的去除 -是硅胶衍生反应中不可或缺的一步。 因为物理吸附水与硅羟基竞争硅烷化试 剂的反应,可能引起键合率的降低和非 特异性吸附的增加,降低填料的性能。 一般通过加热或真空下热处理去 除物理吸附水。 2. 物理性质: 颗粒的形状大小、孔的结构、孔径及其 分布、总孔容、比表面积、高机械强度 以A型与B型硅胶担体的色谱柱分离三环抗抑郁药的比较 色谱柱：150.46 cm；流动相：乙腈-0.025M磷酸钠缓冲液（30：70） ，p H2.5+三乙胺与三氟醋酸各0.2%；流速：1.0ml/min；400C；254nm检测 ；进样5L。 A型：纯度不高的酸性硅胶B型：
3、高纯度的弱酸性硅胶 3.多孔硅胶的制法: 将水玻璃(硅酸钠水溶液)酸化,形成SiO2 胶体溶液,以各种方法聚集成球形粒子,并 转化成干胶; 另外,也可利用正硅酸酯的缩聚和SiO2气 溶胶水溶液喷雾干燥法。 粒度分布及杂质的控制是难点！ 堆砌硅珠法 尿素、甲醛相分离聚合：将适宜浓度的硅溶胶 与一定比例的尿素和甲醛配成水溶液，搅拌均匀令 其产生缩聚反应。待反应进行到一定程度后，便会 产生相分离而从水溶液中沉淀出聚集硅微珠与尿素 甲醛树脂的复合球。将这种复合球收集、洗涤并 在高温炉中煅烧，令树脂分解逸去，剩下的就是多 孔硅胶微球，其直径可以控制在45m或78m之 间。通过二次缩聚反应，直径可加大到1
4、5m。 二.可控孔径玻璃: 含硼的Na2O-B2O3-SiO2系玻璃,热处理时会 相分离，生成溶于酸的Na2O-B2O3相及不溶 于酸的高硅相。以酸处理的方法，将酸可 溶相浸析出来,剩下的高硅相就成了可控玻 璃(SiO2)。控制玻璃的组成及处理条件可 控制生成可控孔径玻璃的孔径、孔容及比 表面积。 1.化学性质: 表面具有游离硅羟基,可以通过各种化学修 饰而得到不同官能团的表面。 缺点：游离硅羟基可能导致非特异性吸附 及蛋白质失活;适应的pH范围有一定的局限 ;制造成本较高。 2.物理特性: 机械强度高,可耐受剧烈、反复的处 理和操作，耐压力强。 孔径分布窄而均匀。 3.制造: 采用普通玻璃制
5、造工艺：精细选择并 控制适宜的相分离温度与时间。孔 径一般控制在25nm到100nm为宜。 三、其它 氧化铝：主要是Al2O3,作为色谱固定相， 主要用于小分子有机物等的分离。限制其 应用的因素在于其难以像SiO2那样通过键合 而得到适应不同分离模式的固定相。 氧化锆：利用与硅胶键合相类似的方法，可 以对其进行表面修饰。 第二节 硅胶的化学修饰与改性 一、表面硅羟基的化学修饰（主要途径） ： 1、氯化反应：可以将硅羟基转化成硅氯基， 硅氯基性质活泼可以与各种化合物反应而引 入相应的基团。这种方法引入的基团是单分 子层的，具有较好的传质能力和色谱性能， 但成本较高。 2、氯硅烷与硅羟基的反应：
6、通过氯硅烷可以将各种烷基链引入硅 胶表面。氯硅烷包括一氯代型，二氯 代型和三氯代型等。P231 3、通过烷氧基硅烷与硅羟基的反应： 烷氧基硅烷与硅胶进行缩合反应，使硅胶 表面带上环氧基或氨基等基团，在此基础 上可以很方便地进一步进行反应或修饰。 这一键合反应可以在水相，也可以在有机 介质中进行。 （a）表面硅羟基与氯二甲基硅烷的反应；（ b）表面硅羟基与三官能团硅烷的反应；（c ）表面硅羟基与三官能团烷基硅烷的反应 与硅胶担体共价键合硅烷的各种类型 二、包敷与涂层： 1. 可通过不同的途径制备稳定的聚合物 涂层。常将选择的聚合物、寡聚物或单体以 适宜溶剂制成溶液，均匀分布于无机基质的全 部表面
7、上，蒸去溶剂后，令高聚物或单体聚合 ，形成致密的聚合物涂层。 2. 亦可将含双键的聚合物涂于硅胶表面，使其 表面带上双键，使其于随后涂敷上去的第二单 体进行共聚。还可以将含有双键的不饱和聚合 物涂于硅胶表面，以自由基引发进一步交联， 以获得理化性质更稳定的涂层。 三、整体修饰： 指利用具有不同官能团的卤代硅烷或 烷氧基硅烷的水解、缩聚反应，直接 制出空间交联型、含不同R基的硅胶 。 四、硅烷化试剂： 氯硅烷：容易和空气中微量水反应， 放出HCl气，对环境造成危害。 烷氧基硅烷：对环境和人体的危害性 小。广泛应用。 各类无机色谱填料 正相色谱填料 反相色谱填料 凝胶过滤色谱填料 高效离子交换色谱
8、填料 高效亲和色谱填料 高效疏水色谱填料 第三节 正相色谱填料 液相色谱分正相和反相色谱（依据相间的相对极性） 正相：固定相极性大于流动相极性， 适用于非极性至中等极性的中小分子化合物 的分离，如脂溶性维生素、甾体激素、医药等 的分离分析。 反相：固定相极性小于流动相极性。 正相色谱液固吸附色谱 柱填料：吸附剂，表面分布有活性吸附位点； 竞争吸附：溶剂溶质分子，溶质溶质分子 柱内保留时间差异 物质分离！ 1.硅胶 吸附色谱中最常用。但样品呈碱性时， 会造成严重吸附，溶质峰拖尾或难以洗脱 ，可选用Al2O3。 Al2O3对于不饱和化合物，特别是芳香族 化合物多核芳烃的保留能力较强，芳香异 构体可
9、得到良好分离。 硅胶 100-200目 2.5KG 生产商:Fisher 产品价格:4500元（RMB） 化学键合固定相： 将各种不同有机基团通过化学反应键合到 载体表面的一种方法。它代替了固定液的 机械涂渍，它的出现是液相色谱法的一个 重大突破。它是目前应用最广泛的一种固 定相。据统计，约有3/4以上的分离问题是 在化学键合固定相上进行的。 2.极性键合相填料 键合固定相类型： 用来制备键合固定相的载体，几乎都用硅胶 。利用硅胶表面的硅醇基(Si一OH)与有机分子可 成键,即可得到各种性能的固定相。一般分3类： （1）疏水基团 如不同链长的烷烃（C8和C18）和苯 基。 （2）极性基团 如氨
10、丙基、氰乙基、醚和醇等。 （3）离子交换基团 如作为阴离子交换基团的胺基、 季镀盐；作为阳离子交换 基团的磺酸等。 键合固定相成键类型 a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广； c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型： SiN 键合固定相的制备 （l）硅酸酯（Si一OR）键合固定相, 最 先用于液相色谱。用醇与硅醇基发生酯化 反应： Si0HROHSiORH20 这类键合固定相的有机表面是一些单体 ，具有良好的传质特性,但这些酯化过的 硅胶填料易水解且受热不稳定，因此仅适 用于不含水或醇的流动相。 共价键键合固定相不易水解，并
11、且热稳定 较硅酸酯好。缺点是格氏反应不方便；当使 用水溶液时，必须限制pH在48范围内。 （2）SiC或Si一N共价键合固定相制备反应如下： （3）硅烷化（SiOSiC）键合固定相 制备反应如下： 这类键合固定相具有热稳定好，不易吸 水，耐有机溶剂的优点。能在70以下 ，PH=28范围内正常工作，应用较广 泛。 第四节 反相填料及色谱柱 非极性固定相，极性流动相 在色谱的应用中，反相模式占57。 反相色谱填料的种类与性质 品种繁多，性质各异。 市场主流：无机材料为基质制备的填料 在硅胶基质的填料中，以键合有C18、C8 、C4及C3的球形、全多孔填料最常见。 参见P239：表116；P2422
12、44：表117。 第五节第八节 其它色谱类型填料 自学！ 请注意掌握几个要点： 色谱的分离原理 色谱填料的种类与性能 色谱填料的制备 常见的色谱填料 第九节 生化分离用色谱填料的新进展 未来液相色谱的特点：两极分化式发展 适应制备色谱需要：高效、高选择性、高速、低成 本 液相色谱 适应分析色谱需要 ：高效、高选择性、高通量、快 速 主要体现： 提高柱效 提高选择性 提高化学稳定性 提高分离速度 提高生物相容性 提高性能重现性 提高性能价格比 具体地： 细粒径填料：粒径减小，理论塔板数增加，但柱子 渗透性降低，操作压力升高。若缩短柱长可适当缓解，但 单柱柱效不明显。 降低硅胶填料的非特异性吸附：长期问题 对碱性溶质非特异性吸附，乃因硅胶中的杂质金属离子 及键合时在硅胶表面引起的硅羟基。 贯流色谱：既有通常的微孔或大孔，又有贯穿整个 颗粒的超大孔。同时具高流速、高效率、高样品负载量和 低操作压力的特点。 整体柱：即连续固定相，用原位聚合和类似浇铸的方 法，形成整体、连续的柱体，不需用细粒径的填料填装。 放大1300倍的君影草 放大10倍的拟南芥根部 Bellco Glass生物反应器 放大13倍的结晶混合物 放大100倍的专业纸纤维 放大200倍的链孢霉 晶体森林 人体免疫系统抵御病菌 鱿鱼吸管 Thank you!
