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1、March 2, 2012 实时荧光定量 PCR介绍 宝生物工程（大连）有限公司 主 要 内 容 Real Time PCR基础知识 1 2 Real Time PCR实验方法 3 Real Time PCR解析方法 4 Real Time PCR应用实例 实时荧光定量PCR介绍 2March 2, 2012 Real Time PCR基础知识 1. Real Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法 Real Time PCR基础知识 1 实时荧光定量PCR介绍 3March 2, 2012 Real Time PCR的用途 Real Time PCRReal
2、 Time PCR用途用途 定性分析定性分析定量分析定量分析 病毒及病原菌定量分析 导入基因拷贝数解析 GMO定量检测 差异显示结果验证 基因芯片结果验证 siRNA效果确认 mRNA表达量分析 病毒及病原菌检测 物种鉴定 基因分型 绝对定量绝对定量相对定量相对定量 实时荧光定量PCR介绍 4March 2, 2012 Real Time PCR的原理 激 发 光 发 射 光 使用Real Time PCR扩增装置实时监测PCR扩增产物并进行分析的方 法。 Real Time PCR Ct值 实时荧光定量PCR介绍 5March 2, 2012 Real Time PCR基础知识 1. Rea
3、l Time PCR的用途及原理 2. Real Time PCR的检测方法 Real Time PCR基础知识 1 实时荧光定量PCR介绍 6March 2, 2012 TaqMan Probe Cycling Probe Molecular Beacon etc. SYBR SYBR Green IGreen I 荧光染料嵌合法 荧光探针法 Real Time PCR的检测方法 实时荧光定量PCR介绍 7March 2, 2012 荧光染料嵌合法（SYBR Green I） SYBR Green I：是一种能结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域的 具有绿色激发波长的染料。 SYBR Gree
4、n ISYBR Green I 实时荧光定量PCR介绍 8March 2, 2012 Primer退 火 F F F F SYBR Green I 法作用机理示意图 Pol. F Primer Pol. 延 伸 F F F F F F Primer热变性 F F F F 实时荧光定量PCR介绍 9March 2, 2012 TaqMan法作用机理 TaqMan探针为一寡核苷酸， 5 端标记一个报告基团（Reporter）， 3 端标记一个淬灭基团（Quencher）。 RQ 实时荧光定量PCR介绍 10March 2, 2012 RQ Primer RQ Primer R Q Primer P
5、ol. Pol. 热变性 退 火 延 伸 TaqMan Probe法原理示意图 实时荧光定量PCR介绍 11March 2, 2012 One-Step RT-PCR 特异性高 多重PCR检出 Probe设计要求高 Probe法 Probe合成费用高 SYBR Green I 法与Probe法比较 常用于mRNA表达量分析等 SYBR Green I 法 简便易行 价格便宜 要求反应的特异性 不能进行多重PCR 常用于SNP解析，病毒、病源菌检测 实时荧光定量PCR介绍 12March 2, 2012 主 要 内 容 2 Real Time PCR实验方法 反转录反应反转录反应 Real Ti
6、me PCRReal Time PCR反应反应 实时荧光定量PCR介绍 13March 2, 2012 RT Primer的选择 Random Primer Oligo dT Primer Gene Specific Primer Random 6mer PrimerGene Specific Primer Oligo dT Primer PCR R-PrimerPCR F-Primer 实时荧光定量PCR介绍 14March 2, 2012 目的片段在距Poly(A) Tail 1.5 kbp 以内适用，RT效率 较高。 One Step RT-PCR 只能使 用Gene Specific
7、Primer， 但不适用于复数基因的检 出。 53 Gene Specific Primer 目的片段 RF AAA 53目的片段 RF 1,500 base Oligo dT Primer Random 目的片段53 RF 目的片段在mRNA任何位 置都能使用。通常mRNA 表达量分析最适。 Oligo dT Primer 53 RF AAA 目的片段 Random 适用于mRNA表达量分析， 提升反应检测的灵敏度。 RT Primer的选择 实时荧光定量PCR介绍 15March 2, 2012 Real Time PCR引物设计 目的是获得目的基因，对非特异性反应和引物二聚 体要求不严格
8、。 目的是让目的基因按照理论值进行扩增，对非特异 性反应和引物二聚体要求严格。 Real Time PCR用引物与普通PCR引物设计要求不同 = 对引物设计要求严格 普通PCR引物 Real Time PCR引物 实时荧光定量PCR介绍 16March 2, 2012 两条引物的Tm值尽量接近，应用专用软件计算Tm值 Tm值 40-60%(最好45-55%) GC含量 Primer长度 80-150 bp(尽量限制在300 bp以内)扩增片段大小 17-25 base 使用BLAST检索，确认引物特异性 特异性 引物内部或两条引物之间避免3 base以上的互补序列 引物3 末端避免2 base
9、以上的互补序列 互补性 3 末端序列 整体上碱基不能过偏 个别部分避免GC rich或AT rich(特别是3 端) 避免T/C连续，A/G连续 序列 3 末端避免GC rich或AT rich 3 末端碱基最好为G 或C 3 末端碱基尽量避免为T 尽量在Exon junction上设计引物，限制基因组DNA扩增 RT-PCR用引物 Real Time PCR引物设计原则 实时荧光定量PCR介绍 17March 2, 2012 探针的Tm比引物高8-10 Tm值 20-24 bp Probe长度 探针5 末端的第一个碱基不能是G5 末端序列 目的序列GC含量相对较高的区域设计 整体上碱基不能过
10、偏 个别部分避免GC rich或AT rich (特别是3 端)；避免T/C 连续，A/C连续 序列 Probe内部或Probe与两条引物之间避免3 base以上的互补序列 互补性 BLAST检索确认Probe特异性 特异性 Real Time PCR用TaqMan探针设计原则 Real Time PCR探针设计原则 实时荧光定量PCR介绍 18March 2, 2012 线性关系、扩增效率确认 检测灵敏度确认 PCR扩增效率（E）：0.8-1.2 35Cycles内可得到好的定量结果。 如果采用SYBR检测方法， 30Cycles内无非特异性产物扩增。 No Template Control
11、确认 30Cycles内无引物二聚体产 生。 相关系数（r2）：大于0.98 反应性能确认 实时荧光定量PCR介绍 19March 2, 2012 主 要 内 容 3 Real Time PCR解析方法 1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析 3. 绝对定量和相对定量解析方法 实时荧光定量PCR介绍 20March 2, 2012 标准曲线制作 扩增曲线标准曲线 标准品梯度的选择：56个梯度 标准品稀释倍数的选择：标准品稀释倍数通常为10 105 104 103 102 101 100 105 104 103 102 101 100 实时荧光定量PCR介绍 21March 2, 2012 标准
12、品的种类 基因组DNA 质粒 Total RNA & cDNA 体外转录RNA DNA样品定量标准品 RNA样品定量标准品 实时荧光定量PCR介绍 22March 2, 2012 质粒标准品构建流程 基因组DNA PCR 目的基因克隆 目的基因 目的基因 目的基因 质粒 质粒提取，OD值定量。将质粒梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准品。 实时荧光定量PCR介绍 23March 2, 2012 体外转录RNA标准品构建流程 RNA纯化后，测OD定量。将RNA梯度稀释至105-101 copies/ul，作为标准 品。 T7 RNA polymerase 体外转录RNA Tot
13、al RNA PCR cDNA RT T7 PromoterTTTTTPCR产物 目的基因 目的基因 目的基因 AAAAA AAAAA 实时荧光定量PCR介绍 24March 2, 2012 理想的标准品扩增曲线 基线平整 Negative Control为水平线 指数区较明显，陡度大 平台区汇于一起 线性范围宽 实时荧光定量PCR介绍 25March 2, 2012 理想的标准曲线 相关系数（r2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.8-1.2，越接近1，越理想。 扩增效率 相关系数 扩增效率（E）计算方法 标准曲线X轴表示起始模板浓度（log10)，Y轴表示Ct
14、值时 E=10-1/a-1 标准曲线X轴表示Ct值，Y轴表示起始模板浓度（log10) E=10-a-1 实时荧光定量PCR介绍 26March 2, 2012 Real Time PCR解析方法 3 Real Time PCR解析方法 1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析 3. 绝对定量和相对定量解析方法 实时荧光定量PCR介绍 27March 2, 2012 融解曲线分析 Tm值是指双链DNA分子解链一半时的温度。 SYBR Green I 法进行检出时， 要根据融解曲线确认PCR产物的特异性。 实时荧光定量PCR介绍 28March 2, 2012 特异性产物 非特异产物 引物二聚体
15、对PCR产物特异性进行分析 融解曲线分析 实时荧光定量PCR介绍 29March 2, 2012 3 Real Time PCR解析方法 1. 标准曲线分析 2. 融解曲线分析 3. 绝对定量和相对定量解析方法 Real Time PCR解析方法 实时荧光定量PCR介绍 30March 2, 2012 绝对定量解析方法 提取样品 引物设计 标准品制备 Real Time PCR反应 数据分析 流 程 实时荧光定量PCR介绍 31March 2, 2012 绝对定量解析方法 通过制作标准曲线来确定样品的初始模板拷贝数或浓度。通常应用于病 毒、细菌、衣原体、支原体的定量检测及转基因食品的检测。 105 104 103 101 扩增曲线图标准曲线图 检测样品 检测样品 102 实时荧光定量PCR介绍 32March 2, 2012 相对定量解析方法 以上条件不可能同时得到满足，必须用内对照基因（管家基因）校正， 进行相对表达量分析。 Sample BSample A 目的基因扩增效率相同 RNA提取效率相同 细胞起始数相同 进行相对表达量分析必要性 实际上目的基因表达量分析 实时荧光定量PCR介绍 33March 2, 2012 相对定量解析方法 管家基因 维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、-actin等。 筛选方法 根据文献提供 通过具体实验筛选 实时荧光定量PCR
