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1、 第十章第十章 紫外紫外- -可见分光光度法可见分光光度法 (Ultraviolet and visible (Ultraviolet and visible spectrophotometry;UV-visspectrophotometry;UV-vis) ) 内容：内容： 1 1 朗伯朗伯- -比尔定律比尔定律 2 2 偏离比尔定律的因素偏离比尔定律的因素 3 3 紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计 要求：要求： 1. 1.掌握掌握Lambert-BeerLambert-Beer定律的物理意义，成立条件，定律的物理意义，成立条件， 影响因素及有关计算；影响因素及有关计算； 2. 2
2、.熟悉紫外熟悉紫外- -可见分光光度计的基本部件，工作原可见分光光度计的基本部件，工作原 理及几种光路类型；理及几种光路类型； 第一节第一节 紫外紫外- -可见分光光度法的基本原理和概念可见分光光度法的基本原理和概念 五五 朗伯朗伯- -比尔定律：比尔定律： (一) Lamber-Beer定律：是吸收光度法基本定律，描述物 质对单色光吸收强弱与液层厚度和待测物浓度之间关系的 定律。 1. 1.公式的推导：公式的推导： 假设一束平行单色光通过一个吸光物体（气体、液体或固体）假设一束平行单色光通过一个吸光物体（气体、液体或固体） 取物体中一极薄层取物体中一极薄层 透光率透光率 吸光度吸光度 上式说
3、明，单色光通过吸光介上式说明，单色光通过吸光介 质后，透光率质后，透光率T T与浓度与浓度C C或厚度或厚度l l 之间是指数函数的关系。而吸之间是指数函数的关系。而吸 光度光度A A与浓度或厚度之间是简单与浓度或厚度之间是简单 的正比关系。的正比关系。 2. 2.讨论：讨论： 1 1）LamberLamber-Beer-Beer定律的适用条件（前提）：定律的适用条件（前提）： 入射光为单色光入射光为单色光 溶液是稀溶液溶液是稀溶液 2 2）同一波长下，各组分吸光度具有加和性）同一波长下，各组分吸光度具有加和性 3. 3.吸光度的加合性：吸光度的加合性：如果溶液中同时存在两种或两种以上如果溶液
4、中同时存在两种或两种以上 吸光物质，只要不互相干扰，则总吸光度是各共存物吸光吸光物质，只要不互相干扰，则总吸光度是各共存物吸光 度的和，即：度的和，即： 吸光度的加合性是计算分光光度法测定混合组分的依据。吸光度的加合性是计算分光光度法测定混合组分的依据。 ( (二二) ) 吸光系数和吸收光谱吸光系数和吸收光谱 1 1吸光系数吸光系数( (absorptivityabsorptivity) )的物理意义：的物理意义： 单位浓度、单位厚度的吸光度单位浓度、单位厚度的吸光度 讨论：讨论： 1 1） E=fE=f（组分性质，温度，溶剂，（组分性质，温度，溶剂，） 当组分性质、温度和溶剂一定，当组分性质
5、、温度和溶剂一定，E=fE=f（），是物质），是物质 的特征性常数，表明物质对某一特定波长光的吸收能力的特征性常数，表明物质对某一特定波长光的吸收能力 。 2 2）不同物质在同一波长下）不同物质在同一波长下E E可能不同（选择性吸收）可能不同（选择性吸收） 同一物质在不同波长下同一物质在不同波长下E E不同不同 3 3）EE，物质对光吸收能力，物质对光吸收能力, , 定量测定灵敏度定量测定灵敏度 定性、定量依据定性、定量依据 2 2吸光系数两种表示法：吸光系数两种表示法： 1 1）摩尔吸光系数）摩尔吸光系数 ： 在一定在一定 下，下，C=1mol/LC=1mol/L，L=1cmL=1cm时的吸
6、光度时的吸光度 2 2）百分含量吸光系数）百分含量吸光系数 / / 比吸光系数：比吸光系数： 在一定在一定 下，下，C=1g/100mlC=1g/100ml，L=1cmL=1cm时的吸光度时的吸光度 3 3）两者关系：）两者关系： 或 不能直接测得，需用已知准确浓度的稀溶液测得吸 光度换算而得。 例如：例如：氯霉素氯霉素(M(M为为323.15)323.15)的水溶液在的水溶液在278nm278nm处有吸收峰。处有吸收峰。 设用纯品配制设用纯品配制100ml100ml含有含有2.00mg2.00mg的溶液，以的溶液，以1.00cm1.00cm厚的吸收厚的吸收 池在池在278nm278nm处测得
7、透光率为处测得透光率为24.3%24.3%，则：，则： 六六 偏离偏离BeerBeer定律的因素定律的因素 1 1 依据依据BeerBeer定律，定律，A A与与C C关系关系 应为经过原点的直线，但事应为经过原点的直线，但事 实上往往容易发生偏离直线实上往往容易发生偏离直线 的现象的现象 2 2 偏离偏离BeerBeer定律的主要因素定律的主要因素 表现为以下两个方面表现为以下两个方面 （一）化学因素（一）化学因素 （二）光学因素（二）光学因素 （一）化学因素：（一）化学因素：溶液中溶质可因浓度的改变而有离解、缔溶液中溶质可因浓度的改变而有离解、缔 合、与溶剂间的作用等原因而发生偏离合、与溶
8、剂间的作用等原因而发生偏离BeerBeer定律的现象。定律的现象。 亚甲蓝单体的吸收峰在亚甲蓝单体的吸收峰在 660nm660nm处，而二聚体的吸处，而二聚体的吸 收峰在收峰在610nm610nm处，随着浓处，随着浓 度的增大，度的增大，660nm660nm处吸收处吸收 峰减弱；而峰减弱；而610nm610nm吸收峰吸收峰 增强，吸收光谱形状改变增强，吸收光谱形状改变 。由于这个现象的存在，。由于这个现象的存在， 而使吸光度与浓度关系发而使吸光度与浓度关系发 生偏离。生偏离。 例例1 1 亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱亚甲蓝阳离子水溶液的吸收光谱 例例2 2 重铬酸钾水溶液的吸收光谱重铬酸钾水溶
9、液的吸收光谱 重铬酸钾水溶液有以下平衡：重铬酸钾水溶液有以下平衡： 若溶液稀释若溶液稀释2 2倍，倍， 离离 子浓度不是减小子浓度不是减小2 2倍，而是倍，而是 受稀释平衡向右移动的影响受稀释平衡向右移动的影响 ， 离子浓度的减少明离子浓度的减少明 显的多于显的多于2 2倍，结果偏离倍，结果偏离 BeerBeer定律，而产生误差。定律，而产生误差。 由化学因素引起的偏离，有由化学因素引起的偏离，有 时可控制溶液条件设法减免时可控制溶液条件设法减免 ，上例若在强酸性溶液中测，上例若在强酸性溶液中测 定或在强碱性溶液中测定都定或在强碱性溶液中测定都 可避免偏离现象。可避免偏离现象。 ( (二二)
10、) 光学因素光学因素 1 1非单色光的影响：非单色光的影响： BeerBeer定律应用的重要前提定律应用的重要前提入射光为入射光为单色光单色光 照射物质的照射物质的连续光连续光经单色器分光后经单色器分光后 并非真正单色光并非真正单色光 其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱其波长宽度由入射狭缝的宽度和棱 镜或光栅的分辨率决定镜或光栅的分辨率决定 为了保证透过光对检测器的响应，为了保证透过光对检测器的响应， 必须保证一定的狭缝宽度必须保证一定的狭缝宽度 这就使分离出来的光具一定的谱带这就使分离出来的光具一定的谱带 宽度宽度 物质对不同波长的光具有不同的吸光系数物质对不同波长的光具有不同的吸光系数 讨论：
11、讨论： 入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状入射光的谱带宽度严重影响吸光系数和吸收光谱形状 1 1 选择较纯单色光（选择较纯单色光（ ，单色性，单色性 ） 2 2 选选 max max作为测定波长 作为测定波长 （EE，灵敏度，灵敏度SS且且 成线性）成线性） 结论结论 ： 2 2杂散光的影响：杂散光的影响： 杂散光杂散光(stray light)(stray light)是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽是指从单色器分出的光不在入射光谱带宽 度范围内，与所选波长相距较远的光。度范围内，与所选波长相距较远的光。 杂散光来源：仪器本身缺陷；光学元件污染造成杂散光来源：仪器本身缺陷；光
12、学元件污染造成 杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值杂散光可使吸收光谱变形，吸光度变值 3 3反射光和散射光的影响：反射光和散射光的影响： 反射光和散射光均是入射光谱带宽度内的光直接对反射光和散射光均是入射光谱带宽度内的光直接对T T产生影产生影 响响 散射和反射使散射和反射使TT，AA，吸收光谱变形。，吸收光谱变形。 注：一般可用空白对比校正消除注：一般可用空白对比校正消除 4 4非平行光的影响：非平行光的影响： 倾斜光使光程倾斜光使光程 ，AA，吸收光谱变形。，吸收光谱变形。 ( (三三) ) 透光率的测量误差透光率的测量误差TT 测定结果的相对误差与透光率测量误差间的关系可由测定结果的相对
13、误差与透光率测量误差间的关系可由 LamberLamber-Beer-Beer定律导出：定律导出： 微分后并除以上式得：微分后并除以上式得： 测定结果的相对误差取决于两个因素：测定结果的相对误差取决于两个因素： 透光率透光率T T和透光率和透光率 测量误差测量误差TT。 TT是测量中的随机误差，来自仪器的噪音是测量中的随机误差，来自仪器的噪音(noise)(noise)，一类与，一类与 光讯号无关，称为暗噪音光讯号无关，称为暗噪音(dark noise)(dark noise)；另一类随光讯号强；另一类随光讯号强 弱而变化，称散粒噪音弱而变化，称散粒噪音(signal shot noise)(
14、signal shot noise)。 1 1 暗噪音暗噪音与检测器和放大电路不确定性有关，与光讯与检测器和放大电路不确定性有关，与光讯 号无关。暗噪音的强弱取决于各种电子原件和线路结构的号无关。暗噪音的强弱取决于各种电子原件和线路结构的 质量、工作状态以及环境条件等，不论是有光照射或无光质量、工作状态以及环境条件等，不论是有光照射或无光 照射，照射， TT可视为一个常量。可视为一个常量。 高精度的分光光度计暗噪音高精度的分光光度计暗噪音TT可低达可低达0.01%0.01%，但，但大多数大多数 分光光度计的分光光度计的TT在在0.2%0.2% 1%1%之间。之间。 今假今假TT=0.5%=0.
15、5%，代入，代入 ，算出不同透光率或，算出不同透光率或 吸光度值时的浓度相对误差，作图。吸光度值时的浓度相对误差，作图。 曲线最低点所对应的曲线最低点所对应的T T或或A A 值，即为最小误差的读数值，即为最小误差的读数 ，将上式的导函数取零值，将上式的导函数取零值 求得：求得： T=0.368; A=0.4343T=0.368; A=0.4343 对应最小测量误差对应最小测量误差 在实际工作中没有必要去寻求这一最小误差点，只要在实际工作中没有必要去寻求这一最小误差点，只要 求测量范围在：求测量范围在： 注意：注意：上述推导结果未考虑上述推导结果未考虑TT的大小变化，而实际上的大小变化，而实际
16、上 TT的大小与测量最适宜范围也有直接关系，所以在高精的大小与测量最适宜范围也有直接关系，所以在高精 度的分光光度计上可以根据仪器性能说明和实际测量结度的分光光度计上可以根据仪器性能说明和实际测量结 果确定适宜的测量范围。果确定适宜的测量范围。 2 2 讯号噪音讯号噪音与光讯号有关与光讯号有关 浓度相对误差与测得值浓度相对误差与测得值 间的关系如图中虚线所间的关系如图中虚线所 示，表明测量误差较小示，表明测量误差较小 的范围一直可延至较高的范围一直可延至较高 吸光度区，对测定有利吸光度区，对测定有利 ，可以不用考虑。，可以不用考虑。 第二节第二节 紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光度计 紫外紫外- -可见分光光度计可见分光光
