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1、重组病毒炎症蛋白长期静脉注射对食蟹猴免疫系统的论文重组病毒炎症蛋白长期静脉注射对食蟹猴免疫系统的论文 【摘要】 目的：研究重组vmip在体内对食蟹猴免疫系统的影响。方法：食蟹猴随机分为阴性对照组（静脉注射人白蛋白）和实验组（分别连续13周静脉注射50、250和1 250 g/kg 剂量的重组vmip），于不同时间采集血液（给药前、给药6周、给药13周和恢复期2周）及各器官、淋巴组织（给药13周和恢复期2周）样品。elisa测定血清中重组vmip抗体，分离外周血单个核细胞（pbmcs），facs计数cd3+、cd4+以及cd8+细胞并测定淋巴细胞转化率；各器官及淋巴组织样品做病理学检查，并采用末
2、端转移酶介导的缺口标记（tunel）法检测淋巴组织细胞凋亡指数。结果：长期大剂量静脉注射重组vmip并不引起食蟹猴产生中和抗体；在用药期间动物外周血cd3+t细胞、cd4+以及cd8+t细胞计数显著性增强（p0.05），cd4+/ cd8+比值仍属正常，同时体外观察到淋巴细胞转化率增加（p0.05）；各器官无病理学改变，淋巴组织出现增生，并且重组vmip注射组食蟹猴增生的淋巴组织细胞凋亡指数与阴性对照组相比无明显改变；在恢复期以上指标均有所降低。结论：在重组vmip对食蟹猴免疫原性不明显的情况下，长期大剂量注射重组vmip具有刺激食蟹猴免疫系统、t淋巴细胞增生和增加t淋巴细胞功能的作用。 【关
3、键词】 重组vmip 食蟹猴 t淋巴细胞 淋巴细胞增生 凋亡 longterm intravenous administration of rebinant viral inflammatory protein intensifies immune system of cynomolgus macaque sun hanxiao, l qiujun, jiang zhenyou, mo xuemei, zhang guang, chen hong, yang qingling. center of genome medicine research, jinan university, guan
4、gzhou 510632, china abstract objective:to observe effects of rebined vmip(rvmip) on immune system of cynomolgus macaques in vivo.methods:cynomolgus macaques were randomized into one negative group and three test groups subjected to human albumin(1%) or rvmip(50,250,1 250 g/kg) continuously for 13w,
5、blood and lymphoid tissue samples were taken at various timepoints of pre and the 6th, 13th and 15th week after animal treatments. serum rvmip antibodies were tested by elisa, peripheral blood mononeuclear cells(pbmcs) were prepared for total t cells(cd3+), cd4+ and cd8+t cells calculation on facs a
6、nd determination of lymphocytes transformation ratio, lymphoid tissues biopsy clippings were examined and cells apoptosis indexes were determined.results:longterm intravenous administration of rvmip didnt raise strong antibody response in cynomolgus macaques. increasing cd3+, cd4+ and cd8+t cell per
7、centages in pbmcs(p0.05) with normal cd4+/cd8+ ratio and lymphocytes transformation ratio(p0.05) were observed during the rvmip administration period. no notable pathological change of various organs was seen and hyperplasia panied by unchanged ai was observed in lymphoid tissues. all of above index
8、es were decreased during recovery period.conclusion:the antigenicity of rvmip in cynomolgus macaques is not significant; longterm rvmip administration could stimulate the immune system by prompting tcells proliferation and functions. key words rebinant viral inflammatory protein；cynomolgus macaques；
9、t lymphocytes；lymphoid tissues hyperplasia；apoptosis 趋化因子和其受体之间的相互作用影响着免疫系统的多个方面，包括白细胞与内皮细胞的相互作用、树突细胞的功能、t细胞的分化和功能、炎症反应和对病毒（hiv1）感染的反应等1，2。Www.COm巨噬细胞炎症蛋白（viral macrophage inflammatory protein，vmip）与人趋化因子mip1具有较高的同源性 3。体外实验研究证明rvmip是广谱的趋化因子受体抑制剂，可以结合cc、cxc、cx3c多类至少8种人趋化因子受体，并能够竞争性抑制hiv与靶细胞上共受体ccr 5、
10、cxcr 4、ccr3等的结合，阻止病毒进入靶细胞，具有抗hiv感染的作用4，5。 趋化因子受体系统与机体免疫系统之间相互作用的复杂性，使得趋化因子抑制剂的体内作用的研究比较困难,而体外研究结果不能确切地反映体内的情况。有鉴于此,对广谱趋化因子受体抑制剂vmip的体内研究具有代表性。在本研究中，我们进行了食蟹猴静脉注射rvmip的长期毒性实验，观察各脏器、淋巴组织的病理学改变并检测了多项免疫指标，研究其对免疫系统的影响。 1 材料与方法 1.1 主要试剂 rvmip注射用原液和冻干粉针剂，rvmip抗原标准品（理化对照品）由暨南大学基因组药物研究所研制并通过国家药品和生物制品检定。125irv
11、mip由中山大学实验核医学教研室标记。rvmip单克隆抗体、猴cd3/cd4/cd8单克隆抗体购自美国r d公司。 1.2 实验动物及给药 食蟹猴24只，雌雄各半，由广东省肇庆市实验动物科技研究中心提供，年龄35岁，体重 3.10.2 kg（雌）， 3.30.2 kg（雄）。动物观察2周，外周血有形成分指标、血液生化学和尿常规均符合要求。动物随机均衡分为4组，每组6只：阴性对照组及低、中、高剂量三个实验组，分别静脉注射人白蛋白（1%）或相应剂量的rvmip（50、250和1 250 g/kg），每天1次，连续13周。观察期间连续监测记录受试动物一般状况、体温、心电图、尿常规及血液学指标。 1.
12、3 样品采集 血液样品分别于给药前2周、给药后6周、13周以及恢复期2周取动物外周静脉血；各脏器以及淋巴器官样品于连续给药13周结束后24小时每组随机抽取3只动物, 以及恢复期2周（停止给药）后每组剩余3只动物, 麻醉后颈动脉放血处死获取。 1.4 各脏器和淋巴组织病理学检查 全面细致观察并记录各器官及淋巴组织的肉眼变化并作常规病理切片检查。脏器包括肾上腺、胰腺、胃、十二指肠、回肠、结肠、垂体、脊髓、前列腺、脑、延髓、心、脾、胸骨（骨和骨髓）、肾、肝、肺、淋巴结、膀胱、子宫、卵巢、甲状腺、胸腺、睾丸（附睾）、视神经和给药部位皮肤。淋巴组织包括淋巴结、脾脏、胸腺和小肠黏膜。 1.5 淋巴组织细胞
13、凋亡检测 取上述淋巴组织石蜡切片，按末端转移酶介导的缺口标记（tunel）法的试剂盒（武汉博士德公司）说明书进行凋亡细胞标记染色。以化疗后病人淋巴结切片作为阳性对照，如细胞核中有棕黄色颗粒，则判定为阳性。每张切片于光镜下计数10个视野（400，104 m2/视野）的阳性细胞百分率，取其平均数。 凋亡指数（ai）=10个视野凋亡细胞百分率平均数1个视野的面积。 1.6 elisa法测定食蟹猴血清rvmip的抗体滴度 按照间接elasa常规操作方法检测食蟹猴血清rvmip的igg抗体：rvmip标准品（1 g/孔）包被酶标板，3%明胶封闭, 以rvmip单克隆抗体为阳性对照，正常猴(阴性对照组)血清为阴性对照，pbs为空白对照。食蟹猴血清样品做系列稀释, 每个样品三复孔。显色反应结束后，用酶标仪（biotke，elx800uv）测定a450。当样品孔a450/阴性对照a4502.1时，判断为rvmip抗体阳性。elisa可检测到阳性的抗体最大稀释度作为该样品的抗体滴度。 1.7 淋巴细胞转化实验 参照以前描述方法分离制备实验不同时期食蟹猴外周血单个核细胞(pbmc) 6。细胞悬浮于rpmi1640培养基中（2106 ml-1）与pha（sigma，100 g/ml）共同培养72小时（37、5%co2），培养结束后做细胞涂片检查
