激光拉曼光谱介绍综述

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1、激光拉曼光谱激光拉曼光谱&共聚焦共聚焦 显微拉曼光谱仪显微拉曼光谱仪 激光拉曼光谱激光拉曼光谱&共聚焦共聚焦 显微拉曼光谱仪显微拉曼光谱仪 武 汉 大 学 测 试 中 心 2012. 122013.01 激光拉曼光谱（激光拉曼光谱（RSRS）仪器分析实验仪器分析实验 光散射现象 为什么晴朗的天空 呈现蓝色？ 朝霞和晚霞呢？ 拉曼光谱的发现 印度拉曼研究院 C. V. Raman是印度一位伟大的物理学家，他因为在光散射 工作和发现拉曼效应而获得诺贝尔奖，当时他是亚洲第一位获此 殊荣的科学家，他同时也作了有关声学、光学、结晶动态学、颜 色和它们在感知上的研究。 拉曼光谱的发现 研究太阳光对苯的散射

2、现 象时的“意外”发现 第一台拉曼光谱仪的 简易光路构型 拉曼光谱的基本原理 高频低频 v 斯托克斯线和反斯托克斯线对称地分布于瑞利线的两侧，这是 由于在上述两种情况下分别相应于得到或失去了一个振动量子 的能量。 v 反斯托克斯线的强度远小于斯托克斯线的强度，这是由于 Boltzmann分布，处于振动基态上的粒子数远大于处于振动激发 态上的粒子数。 拉曼光谱的基本原理 Raman spectrum of CCl4 拉曼光谱的基本原理拉曼光谱的基本原理 拉曼光谱的基本原理 拉曼光谱的基本原理 Avoidance of fluorescence: background-free Raman spe

3、ctra 红外 拉曼 u分子振动谱 u吸收，发展较早 u平衡位置附近偶极矩变化不为零 u与拉曼光谱互补 u实验仪器是以干涉仪为色散元件 u测试在中远红外进行，不受荧光 干扰 u低波数（远红外）困难 u微区测试较难，光斑尺寸约10微 米，空间分辨率差 u红外探测器须噪声高，液氮冷却 ，且灵敏度较低 u多数须制备样品 u水对红外光的吸收 u分子振动谱 u散射，自激光后才发展 u平衡位置附近极化率变化不为 零 u与红外光谱互补 u实验仪器是以光栅为色散元件 u测试在可见波段进行，有时受 样品荧光干扰，可采用近红外 激发 u低波数没有问题 u共焦显微微区测试，光斑尺寸 可小到1微米，空间分辨率好 uC

4、CD探测器噪声低，热电冷却 ，灵敏度高 u无须制备样品，且可远距离测 试 u没有水对红外光吸收的干扰 散射信号量的总计算公式 拉曼 10-30 cm2/分子 红外 10-20 cm2/分子 荧光 10-16 cm2/分子 拉曼光谱的基本原理 灵敏度低 I入射= (103-105) I瑞利 I瑞利= (103-106) I拉曼 分子与光子作用截面（Cross-Section) 拉曼光谱的优点和特点 对样品无接触，无损伤； 样品无需制备； 快速分析，鉴别各种材料的特性与结构； 显微拉曼所须样品量少，且适用样品微区（1微米以下光斑） 高空间分辨率(对包裹体,金刚石压砧中的样品等尤其有用)， 能适合黑

5、色和含水样品； 高、低温及高压条件下测量； 光谱成像快速、简便，分辨率高； 仪器稳固，体积适中，维护成本低，使用简单。 拉曼光谱的优缺点 优点: u可以得到高光谱分辨的谱图 u不受溶剂水的影响 u可以方便的改变激发光的波长 缺点: 灵敏度低 (表面吸附物种) 1 incident photon, 10-6-10 共振拉曼光谱RRS u激光共振拉曼光谱（RRS）产生激光频率与待测分子的某个电子 吸收峰接近或重合时，这一分子的某个或几个特征拉曼谱带强度 可达到正常拉曼谱带的102106倍，并观察到正常拉曼效应中难 以出现的，其强度可与基频相比拟的泛音及组合振动光谱。 u与正常拉曼光谱相比，共振拉曼

6、光谱灵敏提高，可用于低浓度和 微量样品检测，特别适用于生物大分子样品检测。 表面增强拉曼光谱SERS u当一些分子被吸附到某粗糙金属，如金、银、铜的表面时，它们 的拉曼光谱强度会增加104106倍，这种不寻常的现象被称为表 面增强拉曼散射效应，简称表面增强拉曼光谱（SERS）。 u由于SERS有很高的灵敏度，能检测吸附在金属表面的单分子层 和亚单分子层的分子，又能给出表面分子的结构信息，因此它是 一种表面研究的有效技术。 uSERS效应只在少数基体表面能观察到，其中银、金、铜被广泛 做为SERS的金属基体，它们能显示出很大的增强效应。镍、铝等 少数金属也能显示出一定的增强作用，但增强因子小。

7、u金属表面必须被粗糙化一定程度才能显示出SERS效应。实验还 表明，SERS强度与激发光频率、入射角、吸附分子在金属基体表 面的覆盖度、分子离基体表面的距离等有关。 SERS的生物医学应用 Label imaging Label-free imaging Homogeneous assays Highly selective (multiplex) Highly sensitive Simple detection process Limited selectivity Poor universality Limited sensitivity Unsatisfactory biocompat

8、ibility Poor spectral/physical stability Difficult modification High spatial resolution Abundant chemical information Lacking standard database Poor spectral stability From single to nano-aggregate Developing advanced shell materials Multi-targeted imaging 共焦显微拉曼谱仪原理 u光源针孔的作用是将所形成的点光源成像到焦平面样品上，实 现了微

9、小的照明区域。由于只有被照明的部分样品散射或反射的 光信号才会被接受，所以保证了显微镜的横向空间分辨率。在光 源照明区域内，但不在焦平面上的样品也会散射或反射光信号， 背景上的杂散光因为处于样品上离焦区域，所以被与光源针孔共 焦的探测针孔所形成的空间滤波器强烈地衰减。这样对信号的主 要贡献是处于焦平面上的样品被显微镜所观察的那一薄层的信号 ，保证了显微镜的纵向空间分辨率。 共焦显微拉曼谱仪原理 共焦拉曼显微镜的工作原理如图所示，即将激光束经入射针孔（1 ）聚焦于样品表面，样品表面的被照射点在探测针孔（2）处成像，其 信号由在2之后的检测器收集（光路如实线所示）；而当激光在样品表 面是散焦时，样

10、品处的大部分信号被2挡住（光路如虚线所示），无法 通过针孔到达检测器。当我们将样品沿着激光入射方向上下移动，可以 将激光聚焦于样品的不同层，这样所采集的信号也将来自于样品的不同 层，实现样品的剖层分析。 激光共聚焦显微拉曼光谱系统 英国英国RENISHAWRENISHAW公司公司 拉曼光谱仪系统组成部分 激光共聚焦显微拉曼光谱系统 法国法国JYJY公司公司 拉曼光谱仪系统组成部分 不同焦长光谱仪的分辨率 傅里叶变换拉曼光谱仪 Confocal RamanFT-Raman 1. 采用1064 nm的Nd:YAG激光代替了通常的可见激光。 2. 采用Michelson干涉仪代替通常的光栅单色器；瑞

11、利散射光的降低采 用一组滤光片来实现（也称光学过滤），它一般放在干涉仪前。 3. 检测器采用对近红外有灵敏效应的Ge二极管和InGaAs检测器。 D. Bruce Chase，Fourier Transform Raman Spectroscopy J. Am. Chem. SOC. 1986, 108, 7485-7488 傅里叶变换拉曼光谱仪的特点 u由于采用近红外激光激发，可避免荧光干扰，扩大拉曼光谱的应用 范围，有很高的信噪比； u用近红外光激发，能量低，可避免样品的光解和热解； u傅立叶变换拉曼有分辨率高，波数精确和重现性好的优点。测量精 度可达到103 cm-1，并且重现性好； u

12、傅立叶变换拉曼光谱仪的测量速度快，一次扫描可完成全波段扫描 范围测定； u傅里叶变换拉曼光谱仪操作方便。 不足之处：不足之处：如单次扫描信噪比不高；低波数区扫描方面不如色散如单次扫描信噪比不高；低波数区扫描方面不如色散 型拉曼光谱仪；水对近红外有吸收，会影响测试灵敏度等等。型拉曼光谱仪；水对近红外有吸收，会影响测试灵敏度等等。 傅里叶变换拉曼光谱的应用 聚（对苯撑）对苯二甲酰亚胺（左图）和鸡腿骨组织 （右图）的可见光拉曼和傅里叶变换拉曼光谱图 激光功率密度问题 在共聚焦显微拉曼仪器中，激光经显微 镜镜头聚焦于采样点，即使使用的激光 功率很低，到达样品采样点处的激光功 率密度仍然很大。 考虑样品

13、的承受能力，激光功率密度不能太高，否则可能由于光 热或光解作用而使样品发生变化。方法有: 1.采用能量低的激发光 2.降低激光功率: 使用衰减片降低激光功率；小倍数的收集透镜 3.离焦: 让样品脱离激光聚焦焦点，功率密度即成指数下降 显微:1 mW/1m2 1108 mW /cm2 常规:100 mW/1mm2 1104 mW /cm2 距离(m)直径(m)功率密度拉曼强度 01100100 106.90.2550 2516.80.04313 r d x 离焦方法原理 离焦防止光解的例子 镜头的选择 共聚焦拉曼谱仪通常备有几个不同放大倍数或数值孔径的镜 头。要结合不同的实验要求，综合收集效率，

14、空间分辨率及工作 距离等几个因素使用相应的镜头： 如果需要高的空间分辨率则应选择高放大倍数的镜头；如50、 100的镜头 对于易挥发，腐蚀性样品的测试则应选择长工作距离的镜头， 并且一般还要用PVC或PE薄膜包裹来保护镜头，或者可以在样品 上方加窗片来隔离，一可以有效的防止暴露在空气而受到污染,二 也可以有效的保护镜头 如果要高的光收集效率，则选择数字孔径大（通常倍数是高的 放大倍数）的镜头；具体考虑如下： 是显微镜物镜收集光收集光和分辨物体细节分辨物体细节的能力 NA=nsin n:镜头前空间中介质的折射率， ：镜头孔径张角的一半 增大NA的方法： a. 油浴大的n值 b. 高倍镜头大的值

15、c. 盖玻片校正调整光行差 f D NA大 NA小 数值孔径 检测器的优化 强度与灵敏度的选择,信号的binning处理，pinhole，slit的设置， CCD区域的设定-强度与灵敏度是矛盾的统一 当检测弱信号时软件提供一种binning的方法，即牺牲谱图的分辨 率合并几个象素信号的方法来提高信号强度。因此这就要考虑我 们的实验目的，关注的是强度还是光谱的分辨率，从而选取合适 的binning； 还有一种提高强度的方法即加大pinhole和slit，这就减弱了共焦 性能，损失了空间分辨能力。而且pinhole和slit也有一个最佳值 ，超过这个数字的加大毫无意义； CCD区域的设定要根据拉曼

16、光在CCD上的成像位置来确定，选 定的CCD区域必须包括成像区域，太窄会丢失所需的信号，太宽 则使噪音增加。 入射收集方式和样品处理 样品状态处理，固体，液体的样品浓度 拉曼散射截面极小，要提高谱图质量，不仅在仪器上要提高各 个元件的性能，优化采谱参数，还应尽量提高采谱体积内的样品 量，如对于粉末样品，压片平整的表面就更利于拉曼信号的测试 ，液体样品浓度高则信号强，尽量拉长光程。 信号收集方式，垂直入射，侧向入射 为方便样品的放置，有效收集拉曼信号，有垂直入射和用转 角镜的侧向入射两种方式。对不便密封的溶液样品可以将其放 在样品平台的一侧，利用转角镜侧向入射和收集；对大多数样 品则直接垂直入射即可。 采样过程 积分时间和累计次数 显然，积分时间越长信号就越强，但积分时间太长，CCD曝光 饱和，故要想进一步提高谱图质量就要增加累计次数。 光栅的选取:采谱范围的选择 根据需要选择不同分辨率