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1、Chapter 9Chapter 9 色谱技术色谱技术 ChromatographyChromatography 本章主要内容 一、概述一、概述 二、吸附色谱二、吸附色谱 三、分配色谱三、分配色谱 四、离子交换色谱四、离子交换色谱 五、凝胶色谱五、凝胶色谱 六、疏水作用六、疏水作用 七、亲和色谱七、亲和色谱 八、蛋白质分离常用的色谱方八、蛋白质分离常用的色谱方 法法 一、概述 u色层法是目前广泛应用的一种分离技术，本世 纪初俄国植物学家M.Tswett发现并使用这一技术 证明了植物的叶子中不仅有叶绿素还含有其它色 素。 u现在色层法已成为生物工程、生物化学、分子 生物学及其它学科领域有效的分离
2、分析工具之一 。 层析法的发展过程 u1903年 Tswett发表了吸附色谱分离植物色素的论 文，三年后他在另外两篇论文中正式提出色谱法。 u1931年 色谱法提出后，并未立即受到重视。经过 大约20年，由于Lederer的工作，人们才重视色谱技 术。 u1938年 Izmailov和Shraiber第一次使用薄层色谱法 。 u1938年 Taylor和Uray用离子交换分离锂和钾的同 位素。40年代，合成离子交换树脂商品出现后，离 子交换色谱才得到广泛应用。1944年在美国橡树岭 国家实验室和衣阿华州立大学分离和鉴定了稀土元 素。在1944年到50年代中，芝加哥大学和加州大学 完成了超铀元素
3、的分离。 1941年 Martin和Synge发展了分配色谱。 1944年 Martin等发展了纸色谱。 1952年 Martin和James发展了气-液分配色谱。 1956年 Van Deemter等发表关于色谱效率的速率理 论，并应用到气相色谱中。 1957年 制作离子交换色谱氨基酸分析仪。 1959年 在Cordon Conference上提出了第一篇凝胶 过滤色谱的报告。 1963年 Giddings的理论工作为现代液相色谱奠定了 理论基础。 u60年代中期 凝胶渗透色谱出现。 u60年代后期 亲和色谱出现。 u1969年 现代液相色谱开始受到重视。 u有两次诺贝尔化学奖是授予色谱学领
4、域的研 究工作：1948年瑞典科学家Tiselins由于他的关 于电泳和吸附分析的研究获奖，1952年英国的 Martin和Synge因为发展了分配色谱而获奖。 色谱分离方法的分类色谱分离方法的分类 色谱分离方法很多，种类有四、五十种色谱分离方法很多，种类有四、五十种 但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理但常用于生物大分子分离的色谱方法，按机理 分，分， 有以下几种：有以下几种： 吸附色谱吸附色谱 分配色谱分配色谱 离子交换色谱离子交换色谱 凝胶色谱凝胶色谱 色谱系统的基本组成色谱系统的基本组成 u对所有的层析系统来说，必须具备三 个单元部分，一个是固定相，一个是移 动相，另一个是需要离析
5、的样品。 u固相的阻滞作用是由不同的机理产生 的,其中包括相的变化、相的分配、在 溶液中的分子筛效应或电场作用。 色谱分离的基本概念色谱分离的基本概念 uu分配系数分配系数 uu可由可由LangmuirLangmuir方程得出方程得出 uu K Kd d -分配系数分配系数 uuq q、c-c-溶质在固相和液相中的浓度溶质在固相和液相中的浓度 uu保留时间（保留时间（t t R R ）样品从进入色谱柱到流出色谱柱所需要的时间 。 uu保留体积（保留体积（V V R R ）从进样开始到某组分在柱后出现浓度极大值时 流出溶剂的体积。 uu反应样品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力反应样
6、品在柱子中的保留或阻滞能力，是色谱过程的基本热力 学参数之一学参数之一 uu阻滞因子阻滞因子R R f f uu阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物阻滞因子是在色谱系统中溶质的移动速度和标准物 （与固定相没有亲和力的流动相（与固定相没有亲和力的流动相 Kd=0Kd=0）的迁移率之比的迁移率之比 uu其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力其意义在于体现某一种溶质与固定相之间的亲和力 大小大小 洗脱体积 uu色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体色谱柱中，使溶质从柱中流出所需流动相体 积，为洗脱体积积，为洗脱体积 uu不同的溶质，由于和固定相的亲和力的不同不同的溶质，由于和固定相的亲
7、和力的不同 ，洗脱体积也有所差异，洗脱体积也有所差异 色谱柱的理论塔板数、塔板高度 uu反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离反应不同时刻溶质在色谱柱中的分布以及分离 度与柱高之间的关系度与柱高之间的关系 uu理论塔板数的计算方法：理论塔板数的计算方法： uuN-N-理论塔板数理论塔板数 tRtR-保留时间保留时间 uuWW1/2 1/2- -半峰宽半峰宽 WbWb-峰底宽度峰底宽度 uu理论塔板高度：理论塔板高度：L-L-柱长柱长 二、吸附色谱二、吸附色谱 uu原理原理: :利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力利用溶质与吸附剂之间的分子吸附力( (范范 德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢
8、键德华力，包括色散力、诱导力、定向力以及氢键 ) )的差异而实现分离的差异而实现分离 uu关键要素：吸附剂（固定相）和展开剂（流动关键要素：吸附剂（固定相）和展开剂（流动 相）的选择相）的选择 uu吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不吸附剂：氧化铝、硅胶、聚酰胺等，均含有不 饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团饱和的氧原子或氮原子以及能够形成氢键的基团 ，如，如-OH-OH和和-NH-NH 2 2 Adsorption chromatographyAdsorption chromatography 常用的吸附剂： uu氧化铝氧化铝 uu硅胶硅胶 uu活性炭活性炭 uu纤维素纤维素 u
9、u聚酰胺聚酰胺 uu硅藻土硅藻土 展开剂的选择展开剂的选择 uu展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力展开剂极性越大，对同一化合物的洗脱能力 越大越大 uu因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性因此，可以根据实验结果调整展开剂的极性 以获得最佳的分离的效果以获得最佳的分离的效果 uu展开剂选择的原则：展开剂选择的原则： （1 1）对被分离组分应具有一定的解吸附能力）对被分离组分应具有一定的解吸附能力 ，极性应比被分离物质的极性略小，极性应比被分离物质的极性略小 （2 2）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解）展开剂应对被分离物质具有一定的溶解 能力能力 一般吸附色谱的操作程序一般吸附色谱的操作程
10、序 uu根据要分离组分的性质（包括极性、分子根据要分离组分的性质（包括极性、分子 量、分子结构）选择合适的固定相和流动相量、分子结构）选择合适的固定相和流动相 uu吸附操作：选择合适的操作条件（温度、吸附操作：选择合适的操作条件（温度、 pHpH值、流速），进行装柱、平衡、上样，测值、流速），进行装柱、平衡、上样，测 定穿透样品含量以调整操作参数定穿透样品含量以调整操作参数 uu洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节洗脱：采用有机溶剂洗涤、调节pHpH值以及值以及 体系离子强度，最大限度地回收目标产物体系离子强度，最大限度地回收目标产物 三、分配色谱三、分配色谱 uu原理：利用溶质在固定相和流动相之间的
11、原理：利用溶质在固定相和流动相之间的 分配系数不同而分离的方法分配系数不同而分离的方法 uu要素：固定相、载体、流动相要素：固定相、载体、流动相 uu载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体载体：通常为惰性材料，能吸附固定相液体 uu载体种类：载体种类： 硅胶硅胶 硅藻土硅藻土 纤维素纤维素 葡聚糖凝胶葡聚糖凝胶 uu固定相是非极性的，流动相是固定相是非极性的，流动相是极性的极性的 （反相色谱反相色谱法）法） uu固定相是极性的，流动相是固定相是极性的，流动相是非极性的非极性的 （正相色谱正相色谱法）法） 正相色谱 u极性固定相（带有二醇基、氨基、和氰基 的固定相及硅胶、三氧化二铝等）、非极性
12、流动相（如正己烷）的分离方法。根据分子 的极性大小将其分开。 u与固定相产生强极性相互作用的样品分子 难洗脱，在柱内停留比较长的时间。极性较 弱或非极性分子容易洗脱，在柱内停留时间 较短。 u因此，正相色谱可以根据溶剂极性差别而 达到分离的目的。 u正相色谱有氰基柱、氨基柱、硅胶柱和二 醇基柱。 反相色谱反相色谱 u反相层析(Reversed-phase chromatography，RPC)利用非极性的介质为 固定相，极性有机溶剂的水溶液为流动相， 根据溶质极性(疏水性)的差别进行分离。 uRPC中溶质通过疏水性相互作用分配于固 定相表面。RPC固定相表面完全被非极性基 团所覆盖，表现强烈的
13、疏水性。采用极性有 机溶剂(如甲醇、乙腈等)或其水溶液进行洗 脱。 uu载体：微粒多孔硅胶（粒径载体：微粒多孔硅胶（粒径5m20 m 5m20 m ） Hypersil Spherosil XOB075Hypersil Spherosil XOB075 uu固定相：固定相：C C18 18、 、C C 8 8 烷基链，烷基链，C C 8 8 适于分离蛋白适于分离蛋白 质质 C18C18适于分离核酸适于分离核酸 苯基苯基 uu流动相的选择流动相的选择 通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇通常采用有机溶剂，乙腈、异丙醇、正丙醇 和四氢呋喃和四氢呋喃 Source RPC 30m 15m 5m I
14、nfluence of Particle Size on the Separation effect 四、离子交换色谱四、离子交换色谱 uu以离子交换树脂作为固定相，选择合适的以离子交换树脂作为固定相，选择合适的 溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲溶剂作为流动相，使溶质按照其离子交换亲 合力的不同而得到分离的方法合力的不同而得到分离的方法 常用的离子交换树脂 uu葡聚糖凝胶型葡聚糖凝胶型 DEAE-DEAE-SephadexSephadex A-25 A-25，QAE-QAE-SephadexSephadex A-25 A-25 ，CM-CM-SephadexSephadex C-25 C
15、-25，SP-SP-SephadexSephadex C-25 C-25 uu纤维素系列离子交换剂纤维素系列离子交换剂 DEAE-Sephacel DEAE-Sephacel CellexCellex系列系列 uu琼脂糖系列离子交换剂琼脂糖系列离子交换剂 SepharoseSepharose系列系列 Sepharose CL-6B, Sepharose Sepharose CL-6B, Sepharose Fast FlowFast Flow Bio-Gel A Bio-Gel A 系列交联琼脂糖离子交换剂系列交联琼脂糖离子交换剂 uuSource Source 系列离子交换剂系列离子交换剂
16、特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压特点：介质均匀、分辨率高、流速快、反压 低低 阳离子交换树脂阳离子交换树脂 S S系列系列 阴离子交换树脂阴离子交换树脂 Q Q系列系列 uuMonoBeadsMonoBeads 系列离子交换剂（系列离子交换剂（PharmaciaPharmacia） 特点：介质为亲水性聚醚，具有和特点：介质为亲水性聚醚，具有和SourceSource系系 列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。列相同的优点，但动态载量更大，寿命更长。 同样分为同样分为Q Q系列和系列和P P系列系列 原理 u离子交换层析(Ion exchange chromatography，IEC)利用离子交换剂为固 定相，是根据荷电溶质与离子交换剂之间静 电相互作用力的差别进行溶质分离的洗脱层 析法。 洗脱方法 uIEC操作很少采用恒定洗脱法，而多采用流 动相离子强度线
