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1、重庆医科大学学生创新实验项目 申 请 书 项目名称：双酚A与自身免疫性卵巢早衰关联性探究申 请 者：邓政道 田素雯 陈汉 宁爽 指导教师：詹平 韩令力单 位：公共卫生学院电 话：15215001926申请日期 ：2011年 2月 1日重庆医科大学实验教学管理中心研究项目项目名称双酚A与自身免疫性卵巢早衰关联性探究所属学科环境卫生申请金额 3200元起止时间2009年 月至 年 月项目性质学生自选研究课题型科研小组成员姓名性别年级电话及电子邮箱邓政道男09临床田素雯女09预防陈汉男09儿科宁爽女09儿科詹平 女 韩令力 女 angel_指导教师研究内容和意义简介(400500字)双酚A(Bisp
2、henol A，BPA)作为一种环境雌激素，广泛存在于日常生活用品中。如罐头内包装、食品包装材料、婴儿用瓶等塑料工业制品1,2，可通过溶出被人体吸收，调查发现95%的人群血清BPA含量为0.56.8ug/L34。据有关免疫学研究报道，部分POF患者存在有多种自身免疫性抗体5或伴有自身免疫性疾病。已经发现的许多证据提示，卵巢早衰（Premature ovarian failure，POF）可能是一种自身免疫性疾病损害的结果67。POF对机体各大系统都会有不良影响，如患者常有抑郁、焦虑、敌对、悲伤和无奈等精神方面的表现89，对女性的身心健康极为不利。有报道BPA对机体免疫系统有双向调节作用【10】
3、。然而，对于人体中BPA是否影响卵巢功能，导致POF，以及其作用机制研究甚少。因此，本实验参考了相关文献1112，设计了合理的染毒剂量范围，采用BPA灌胃,给予小鼠不同浓度的BPA,并且运用测定卵巢脏器系数、血清激素水平的变化(E2、FSH、LH)，卵巢组织学改变、ELISA法检测抗卵巢抗体（AOAb）的表达等实验技术，研究BPA对小鼠卵巢功能的影响，并探讨其作用机理，为进一步研究BPA与自身免疫性卵巢早衰的关系提供实验依据，同时也可以建立起运用BPA造成POF的建模，为目前POF的就建模提供简易可行的方法。一、立论依据(项目的研究意义和国内外研究现状分析，附参考文献) 双酚A是环境雌激素的一
4、种其分子式如图，分子质量为228.28,比重1.195，熔点153，不溶于水，易溶于醇、醚、丙酮及碱性溶液，它是制造聚碳酸脂、环氧树脂、聚树脂、聚酚氧树脂、抗氧化剂等物质的前体物质，广泛应用于杀真菌剂、染料及机械仪表、医疗器械、电讯器材、罐头内包装、食品包装材料与饮料容器、餐具、婴儿用瓶的生产以及作为牙齿密封剂、牙科填充剂的原料之一。2007年、2008年全球双酚A消费量分别达到4ll万t、440万t。其中，美国分别为93万t、94万t，欧洲分别为116万t、118万t，亚洲分别为202万t、228万t 13可见目前人们对BPA的依赖性越来越高。该物质可通过吸入或食入进入体内，对人体产生毒害作
5、用。早在1938年Dodds等就已发现BPA具有雌激素活性，是一种“环境雌激素”。BPA可通过与雌激素受体结合或影响细胞信号传导途径等其他方式模仿或干扰内源性雌激素作用发挥拟雌激素样效应。1993年，Krishnan报道BPA在哺乳动物体内的弱雌激素活性后，BPA对环境和人类健康的影响引起普遍关注。2008年，Okada等将含有5 mg BPA的硅胶管植人交配前的ICR雌性小鼠，可明显降低哺乳30 d的雄性子代小鼠睾丸曲细精管成熟精子细胞数量。2010年，国家日用小商品质量监督检验中心发布塑料玩具中酚类环境雌激素在模拟汗液和唾液中溶出行为研究，说明人们开始慢慢关注BPA。Howdeshell等
6、报道，子宫内BPA暴露剂量为2.4 ugd可引起雌性子鼠动情周期提前研究表明，BPA处理后生育指数和妊娠率随染毒剂量增加而下降， 着床前死亡率、吸收胎率、死胎率均随染毒剂量增加而升高，而活胎率随剂量增加而下降14Can等用l0 mM 和30 mM 的BPA处理MI期小鼠卵丘卵母细胞复合体， 发现BPA可延迟卵母细胞bill期纺锤体的形成， 说明BPA对减数分裂的卵母细胞的发育有阻滞作用。Sakazald ，研究发现BPA能通过ER介导， 干扰T、B淋巴细胞的有丝分裂，影响机体的免疫功能 15大鼠围生期摄入BPA，其子代成熟后用孔板和迷宫测试，发现雄性和雌性的行为分别受到不同影响：雄鼠的探索动力
7、和躁动感减退，雌鼠的运动活力和探索动力减弱，可见环境雌激素还可影响哺乳动物行为和精神运动，说明了BPA还会对神经产生毒性16总之，BPA对机体产生的影响是多方面的，对动物的生殖、发育、肿瘤发生、神经系统、免疫系统功能等都有影响17。卵巢早衰系由多种病因所致的卵巢功能过早衰竭，多发生于40岁以下妇女。临床表现为继发性或原发性闭经，以血清中雌二醇(E2)水平下降(E240UL和LH30UL)为特征，并伴有不同程度的一系列低雌激素症状，如：潮热、多汗、面部潮红、性欲低下等。迄今为止该病病因和发病机制尚不清楚，故无有效的防治方法。多数学者认为POF最常见的原因是自身免疫功能异常，其次为遗传因素、代谢因
8、素、理化、药物及感染因素等18。首先，有文献表明双酚A对小鼠免疫系统的影响具有双向调节作用19。即在低剂量时对体液免疫和细胞免疫功能具有增强作用，而在较高剂量时则具有抑制作用。分子免疫学研究结果表明：部分卵巢早衰是一种自身免疫性疾病20。依据是该类患者中存在多种自身免疫性抗体或伴有自身免疫性疾病。并且多数学者认为POF最常见的原因是自身免疫功能异常（有文献报道称，POF患者抗卵巢抗体(AOAb)阳性率可达到l8 7021）。随着工业制造业的发展，人们生活中接触到的含BPA成品也越来越多 ，我们不难推测是否是因为生活中大量使用这类物品，BPA浸出后被人体吸收造成免疫功能的问题，进而对卵巢功能也造
9、成影响18。另外，BPA也影响卵巢细胞外基质的稳定性（人体细胞体外培养实验显示：BPA染毒体外受精患者的黄体颗粒细胞，低浓度的BPA能引起黄体颗粒细胞基质金属蛋白酶9(MMP一9)含量增加，提示BPA可能影响卵巢细胞外基质的稳定性22），使得部分免疫细胞对不稳定卵巢细胞外基质作用，或者与基质内细胞作用，进而出现过多AOAb或者甾体激素分泌细胞抗体等进而造成对卵巢的损害，出现自身免疫疾病,促进POF的发生18。因此，我们根据BPA影响卵巢细胞外基质的稳定性，认为卵巢细胞外基质的稳定性被打破后，使得卵巢内卵母或者颗粒细胞入血，造成AOAb的产生，引起POF, 同时BPA进入机体后，影响机体免疫系统
10、，造成免疫细胞异常，同时也抑制免疫T细胞的活性或者使得其数量下降，免疫应答过程中负调节作用减弱,由此产生T辅助细胞失控，促进B淋巴细胞产生自身抗体，免疫亢进2324，进一步促进POF的发生, 也有文献表明POF患者中CD4+升高，CD8+下降, CD4+/CD8+升高2425，促进B细胞产生自身免疫抗体，即免疫亢进，如果此时POF患者又接触BPA，当它作用妇女卵巢时，进而还可以加大AOAb的产生量，使得POF进一步恶化。综上所述：我们猜想BPA对卵巢功能很可能有影响，甚至出现功能严重衰退。 同时现在人们的环保意识普遍不高，无论是食品内包装还是婴儿奶嘴，奶瓶等均会含有BPA，然而生产厂家不注重B
11、PA的添加使用，对婴儿的发育是非常不利的，同时如果妊娠期妇女大量接触BPA高含量成品，对其体内胚胎的发育同样也是非常不利的，由此我们设计出这个实验，根据常人BPA血清含量，设置浓度梯度，不仅可以提醒大众选择合格的生活用品，也为目前塑料制造业等提供一个科学环保的BPA浓度参考值。目前对于卵巢早衰及其动物模型的研究有用粗制的卵巢抗原免疫动物用透明带(ZP)抗原或纯化ZP3抗原免疫动物手术型POF动物模型其他药物型POF动物模型化疗所致卵巢早衰动物模型的建立，初生小鼠胸腺切除模型2627，如果BPA可以造成POF，那么就可以为建立雌性动物POF模型提供了另一种新方法，并且实验手段简单可行，为目前PO
12、F的研究以及治疗提供实验基础。上文Can等的实验也进一步说明是BPA对免疫系统的影响，结合到POF的发生在一定程度上是由于免疫系统的异常导致的自身免疫疾病。因此，我们猜想BPA先影响免疫功能，然后导致免疫方面的紊乱导致自身免疫性POF，同时目前关于BPA，只有其对卵巢的相关酶、卵巢细胞活性的研究，还未曾进行过对BPA与POF相关联的研究。而且，也为下一步对BPA是否通过影响免疫系统，使得免疫功能紊乱，使得机体免疫耐受崩溃导致自身免疫性POF提供基础。卵巢早衰目前严重影响女性的身心健康，若通过本实验找到BPA与POF是否存在潜在联系性，不仅为POF是一种自身免疫性疾病提供了佐证，也对女性的健康具
13、有较大的积极意义，并且可以带动国人的环保，绿色理念，为环境的保护以及大量含BPA的各种成品制品提供一个科学可行的参考数据，为国内环保，健康作出应有的贡献。二、研究方案研究目标1. 探讨BPA是否能够造成卵巢早衰2.在实验目标1的基础上进一步证明BPA是否能够使机体卵巢组织的自身免疫耐受出现崩溃，发生过强的自身免疫时，产生抗卵巢抗体等导致卵巢功能衰退研究内容环境雌激素BPA对POF关联性研究：设置BPA的剂量梯度是：20mg / kg、40 mg / kg、80 mg / kg、160 mg / kg 、320 mg / kg。观察卵巢脏器系数、卵巢组织学改变、ELISA法检测AOAb，并且用P
14、OF相关诊断或者判定指标评判是否有卵巢早衰发生的迹象，从而发现BPA与POF的潜在相关性，并且通过检测AOAb浓度，验证BPA是否产生过强的自身免疫，产生自身抗体AoAb,导致卵巢功能衰退,出现自身免疫性POF。研究方法28染毒品制备：BPA（纯度均大于等于9729(终浓度不大于0.01%29)后，用玉米油稀释，配成浓度分别为：0.8 gL，1.6 gL，3.2 gL，6.4 gL，12.8 gL， 4冰箱保存。实验前做小鼠阴道涂片无性周期紊乱。实验动物：78周龄昆明小雌鼠，体重20g。染毒方法：按2.5mL/100g体重灌胃染毒。染毒剂量：20mg / kg、40 mg / kg、80 mg / kg、160 mg / kg 、320 mg / kg【剂量设置依据】本实验染毒剂量设定参照了文献1112 。【实验设置】【阳性对照组设置】 选昆明小雌鼠8只设计的阳性组打算用文献32的方法建立小鼠POF模型，然后用患鼠的特定指标强化我们实验阳性组的是否患POF判断使用白消安(BUS)对每只小鼠12mgkg皮内注射,环磷酰胺（CTX）对每只小鼠120 mgkg腹腔注射，40天后，取样，处死小鼠，进行测定卵巢脏器系数、血清激素水平的变化(E2、FSH、LH)，卵巢组织学改变
