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1、天津医科大学 博士学位论文 视网膜母细胞瘤中Legumain的表达及其对临床病理和预后的影 响 姓名：容维宁 申请学位级别：博士 专业：眼科学 指导教师：孙丰源 20100501 天津医科大学博士学位论文 中文捅要 目的：L e g u m a i n 是最近新发现的一个半胱氨酸内肽酶家族新成员，在恶性实体 肿瘤中高表达，与恶性肿瘤的浸润、侵袭、转移和预后密切相关。目前国内外 尚未见关于L e g u m a i n 与视网膜母细胞瘤的相关研究报道。本研究利用分子生物 学技术检测L e g u m a i n 在视网膜母细胞瘤细胞系和视网膜母细胞瘤组织中的表达 及其与视网膜母细胞瘤临床病理指标
2、之间的关系和对预后生存的影响，旨在为 视网膜母细胞瘤的临床预后判断寻找一个新的指标，帮助辨认高危瘤，以便更 好的指导临床治疗。 材料与方法：应用R T - P C R 、W e s t e r n B l o t 和免疫荧光技术对视网膜母细胞瘤Y 7 9 和W E R I R b 1 细胞系中L e g u m a i n 的表达情况进行检测；应用免疫组化染色法对 1 9 9 9 年1 月2 0 0 9 年1 2 月在天津市眼科医院就诊并行眼球摘除术的1 0 6 例视网 膜母细胞瘤病理组织切片进行L e g u m a i n 染色，同时收集患儿各项临床病理特征， 进行病理切片复习，根据患儿的
3、不同情况采取不同的方式进行预后随访，利用 S P S S l 6 0 软件，通过卡方检验分析L e g u m a i n 表达情况与视网膜母细胞瘤患儿的 临床病理特征之间的关系，用K a p l a n M e i e r 法及L o g r a n k 检验进行单因素生存 分析初步筛选与视网膜母细胞瘤预后相关的风险因素。 结果：在m R N A 和蛋白水平上，L e g u m a i n 在视网膜母细胞瘤Y 7 9 和W E R I R b 1 细胞系中均有表达，而Y 7 9 细胞系中L e g u m a i n 在基因和蛋白水平上的表达均高 于W E R I R b 1 细胞系。通过
4、对1 0 6 例视网膜母细胞瘤组织进行免疫组化染色发 现，有2 6 例切片L e g u m a i n 呈阴性表达，4 2 例呈弱阳性表达，3 8 例呈强阳性表 达，L e g u m a i n 阳性表达率为7 5 ，在视网膜母细胞瘤的肿瘤血管内皮细胞中可 见L e g u m a i n 强阳性表达。当肿瘤侵犯视神经时，视神经纤维的L e g u m a i n 表达 明显增高。通过统计学分析发现，L e g u m a i n 表达水平与视网膜母细胞瘤患儿的 病程、有无眼部组织浸润特别是视神经侵犯程度密切相关( p 0 0 5 ) ；视网膜母细胞瘤患儿的预后与L e g u m a i
5、 n 表达水平、患儿的初诊 年龄、病程、临床分期以及视神经侵犯程度有关( p 5 m i n 依次加入如下试剂： R e c o m b i n a n tR n a s i nR i b o n u c l e a s eI n h i b i t o r M - M L VR e r v e r s eT r a n s c r i p t a s e 用水补至1 5 I _ t l ，将之前E P 管罩的5 p l 与之混合 C P C R 反应条件 2 5 4 2 4 反应结束后取出一2 0 保存备用 ( 3 ) P C R 反应： l O 4 1 1 1 2 A I M 1 l 0
6、5 “l 1p l 1 5 m i n 6 0 m i n f o r e v e r 天津医科大学博士学位论文 一、L e g u m a i n 在视网膜母细胞瘤细胞系中的表达 a P C R 反应体系：( 5 0 I - t 1 ) ： 1 0 B u f f e r ( 含M g C l 2 1 0 m M ) 4 d N T P ( 1 0 m M ) 引物( 2 0 p m o l p 1 ) T a q D N A 聚合酶( 5 U p 1 ) c D N A ( 7 0 n g p 1 ) 加消毒蒸水至5 0 1 a i b P C R 反应条件： 9 5 9 5 5 5 7
7、2 7 2 4 5 1 a l 1 p l 2 p l 0 5 1 a l 1 1 1 1 5 m i n 3 0 s e e 3 0 s e c2 5 - 3 0 c y c l e s 3 0s e c 5m i n f o r e v e r ( 4 ) P C R 产物鉴定：P C R 反应结束后，将P C R 产物进行1 5 琼脂电泳以证实 该扩增片段为目的片段，并观察扩增效率。 a 1 5 琼脂糖凝胶的制备( 4 0 m 1 ) ：称取琼脂糖粉0 6 9 放入烧杯中，1 0 T A E 2 m l ， 加蒸馏水至4 0 m l ，微波炉加热溶解，于6 0 。C 左右加入E B 缓冲
8、液( 1 0 m g m 1 ) 2 I t l 混匀后灌入胶槽中，放置3 0 分钟左右使其凝固； b 将凝固好的胶放入一盛有1 T A E 缓冲液的电泳槽中，混有加样缓冲液 D N A m a r k 和P C R 样本平行加入凝胶的加样孔中； c 电泳：1 1 0 V 恒压电泳约2 0m i n ，通过凝胶成像系统观察分析，以G A P D H 作 为内参照。 1 1 5 免疫印迹( W e s t e r nB l o t ) ( 1 ) 蛋白的提取及定量 a 1 6 0 0 9 离心5 分钟分别收集上述两种视网膜母细胞瘤细胞( 1 1 0 6 个细胞) ， 用冰浴过的P B S 漂洗2
9、 次； b 将细胞移至冷的E p p e n d o r f 管中，加冰浴过的R I P A 细胞裂解缓冲液轻摇，冰 浴4 5m i n 后4 。C 、1 2 0 0 0g 离心1 5m i n ，收集上清； C 按B C A 蛋白检测试剂盒的说明书测定其蛋白浓度。其原理：蛋白和铜二价离 子在碱性条件下反应生成铜一价离子，铜一价离子和B C A 生成螫和物，5 6 2 n m 天津医科人学博士学位论文一、L e g u m a i n 在视网膜母细胞瘤细胞系中的表达 处测定O D 5 6 2 值。其操作步骤：取1 0p l 样本稀释1 0 倍后加入到含2m lB C A 工 作液( A 液：B
10、 液= 5 0 ：1 ) 的试管中，3 7 。C 孵育3 0m i n ，室温下5 6 2n l n 处测定 O D 5 6 2 值，计算蛋白含量。 ， ( 2 ) 蛋白的S D S P A G E 电泳 a 清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸洗洁精轻轻擦沈。两面都擦沈 后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后用热风吹干。将吹干的玻璃体对齐后放 入央中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。( 操作时要使两玻璃板对齐，以免 漏胶) ； b 1 0 S D S P A G E 分离胶的制备：在一5 0 m l 离心管中依次加入下列试剂：H 2 0 1 9 m l ，3 0 A c r y l a m
11、i d e1 7 m l ，1 5 MT r i s H C I ( p H 8 8 ) 1 3 m l ，10 S D S0 0 5 m l ， 1 0 过硫酸铵0 0 5 m l ，T E M E D0 0 0 2 m l ，混匀，用l m l 加样枪吸取l m l 胶沿玻 璃板缓慢加入至凝胶的高度约为6 5 c m 左右，预留约1 5 c m 高度配制浓缩胶。然 后在胶上用水进行液封。室温放置0 5 1 小时左右至聚合完全。当水和胶之间有 一条折射线时，说明胶己凝固。再等3 m i n 使胶充分凝固就可将水倒去，并用吸 水纸吸干； C 5 浓缩胶的制备：在一5 0 m l 离心管中依次加
12、入下列试N - H 2 01 4 m l ，3 0 A c r y l a m i d e0 3 3 m l ，1 5 MT r i s H C I ( p H 6 8 ) 0 1 3 m l ，1 0 S D S0 0 1 m l ，1 0 过硫酸 铵0 0 1 m l ，T E M E DO 0 0 1 m l ，混匀，将玻璃板中的剩余空间灌满浓缩胶，将梳 子水平插入浓缩胶中。由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体 积减小，所以在浓缩胶凝固过程中要经常在两边补胶。凝胶聚合约0 5 1 小时。 待到浓缩胶凝固后将其从架子上取下，备用； d 将蛋白样品与5xL o a d i n g
13、b u f f e r 按5 ：1 混合，沸水浴5m i n 使蛋白完全变性； e 将凝胶固定电泳装置上，并在电泳槽内加入1X 电泳缓冲液，拔掉梳子，按预 定顺序上样，每孔上样5 0p g 蛋白，标准孔中加入等体积的分子量M a r k e r 。积层 胶6 0 V 电泳，分离胶9 0 V 电泳。电泳至溴酚蓝刚跑出即可终止。 ( 3 ) 蛋白从S D S P A G E 转移至P V D F 膜 a 按7 0 0 m l 转移缓冲液，2 0 0 m l 无水甲醇，1 0 0 m lH 2 0 的比例配置转移液l L 。 将其放置4 。C 冰箱预冷4 小时备用； b 剪一张与凝胶大小一般的P V
14、 D F 膜，将其在无水甲醇中浸泡1 5 s ，保证膜由不 透明变成半透明；小心将膜放入双蒸水中浸泡2 m i n ；小心将膜放入转移液中平 衡至少5 分钟； 天津医科大学博十学位论文 一、L e g u m a i n 在视网膜母细胞瘤细胞系中的表达 C 将夹子，两张海绵挚，两张厚滤纸放入转移液中浸泡备用； d 将央子打开，使黑的一面保持水平，在上面垫一张海绵垫，用玻璃板来回擀 几遍以去除罩面的气泡。在海绵挚上挚一层厚滤纸，一手固定一手用玻璃板擀 去其中的气泡； e 将玻璃板取下，撬去小玻璃板，将浓缩胶轻轻刮去，避免把分离胶刮破，同 时在胶的右上角进行标记。小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整
15、使其与滤纸 对齐，轻轻用玻璃棒擀去气泡。将P V D F 膜盖于胶上并除去气泡。在P V D F 膜 上盖一层厚滤纸并去除气泡。最后盖上另一个海绵垫，赶出气泡后就可合起央 子。整个操作过程需要在转移液中进行，保证膜两边的滤纸不能互相接触，以 免发生短路； 将夹子放入转移槽中，要使夹子的黑面对槽的黑面，夹子的红面对槽的红面。 电转移时会产热，在槽的一边放入一个冰袋来降温，将预冷的转移液倒入槽中。 将转膜装置置于冰盒中，8 0 v 转膜1 5 h ； g 转膜结束后在膜上标记，以判断膜的正反面。将膜用1 丽春红液染5 m i n ， 用水冲沈表面浮色就可看到蛋白条带，可以初步检测转膜是否成功，看到
16、条带 后用清水将P V D F 膜漂沈干净备用； ( 4 ) P V D F 膜的免疫学检测及结果分析 a 将膜用T B S T 在摇床上漂沈3 遍，每遍5 m i n ，将其转移至含有封闭液的平皿 中，室温下，用封闭液在摇床上摇动封闭2 h 或4 “ C 过夜，如果预实验结束后发 现背景较亮，可以适当延长封闭的时间； b 封闭结束后，将封闭液倒掉，将膜用T B S T 于摇床上漂洗三遍，每遍5 m i n ， 将稀释好的抗加入平皿中，置于4 “ C 摇床上过夜； C 一抗孵育结束后，将膜用T B S T 于摇床上漂沈三遍，每遍5 m i n ，将相应的稀 释好的二抗加入平皿中，室温下孵育l h ； d 二抗孵育结束后，将膜用T B S T 于摇床上漂洗三遍，每遍5 m i n 。 ( 5 ) E C L 化学发光，显影，定影 a 将A 和B 两种试剂在离
