分子生物学方法(上)演示文稿

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1、第七章 分子生物学研究方法 第一节 重组DNA技术回顾 第二节 DNA基本操作技术 第三节 RNA基本操作技术 第四节 SNP的理论与应用 第五节 基因克隆技术 第六节 蛋白质组与蛋白质组学技术 Date l1 第一节 重组DNA技术回顾 一、重组DNA技术发展史上的重大事件 第一，在20世纪40年代确定了遗传信息的携带 者：即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质， 解决了遗传的物质基础问题； Date l2 第二，50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模 型和半保留复制机制，解决了基因的自我复制 和世代交替问题； 第三，50年代末至60年代，相继提出了“中心 法则”和操纵子学说，成功地破译了遗传

2、密码 ，阐明了遗传信息的流动与表达机制。 Date l3 l但是： l当时由于缺乏有效的分离和富集单一DNA分子 的技术，科学家无法对这类物质进行直接的生 化分析。随着DNA分子体外切割与连接技术及 核苷酸序列分析技术的进步直接推动了重组 DNA技术的产生与发展。 Date l4 重组DNA技术（recombination）： 是应用酶学方法，在体外将不同来源的 DNA分子通过酶切、连接等操作重新组装成 杂合分子，并使之在适当的宿主细胞中进行 扩增，形成大量的子代DNA分子的过程。 Date l5 工具酶： 限制性核酸内切酶（restriction endonuclease ） DNA连接酶（

3、DNA ligase） 工具酶的发现和应用是现代生物工程技 术史上最重要的事件。 Date l6 （一）限制性内切酶(RE) 1、概念：一类能识别和切割双链DNA分子中特 异核苷酸序列的DNA水解酶。 2、分类： I型 、II型 、型 Date l7 类型II：识别位点和酶切位点一致，具特异 性。单体酶，性质稳定，Mg2+为辅助因子。目前 已分离了数百种。 类型I：识别的DNA序列长约十几个bp；酶 切位点在距识别位点1kb左右处随机切割，非特 异性；复合酶，无使用价值。 类型：酶切位点在识别位点下游24-26bp 处， 非特异性。 单体酶，如Hga I: GACGCnnnnn Date l8

4、 3、II型限制性内切酶的基本特性 l5 G C T G A A T T C G A G 3 l3 C G A C T T A A G C T C 5 lEcoR I的识别序列 lEcoR I的切割位点 (1)识别dsDNA分子中48 bp的特定序列 (2)大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧 (3)识别切割序列呈典型的旋转对称型回文结构 Date l9 EcoRI等产生的5粘性末端 5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5 EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A

5、-C-T-T-A-A-P OH-G-C-T-C 5 退火4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 3 3 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5 P OH Date l10 （二）（二）DNADNA连接酶连接酶(ligase)(ligase) 将两段DNA片段连接起来的酶称为DNA连接酶。 1、E.coli DNA ligase: 连接粘端,催化需要NAD+参与 2、T4DNA ligase: 连接粘端和平端，催化需要ATP参与 都不连接单链 Date l11 DNADNA连接酶的基本性质连接酶的基本性质 l修复双链DNA上缺口处的磷酸二酯键 l nick OH

6、P l5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 3 l3 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5 l P OH l DNA连接酶 l5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 3 l3 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5 Date l12 二、基因克隆的载体 克隆用载体：是指具备自我复制能力的DNA分子。 常见的分子克隆载体有：病毒、噬菌体、质粒。 克隆用载体的选择 具备复制原点，能够自我复制 具备适合的酶切位点，且不在原点 具有筛选指标 对抗菌素的抗性 基因产物的显色反应 Date l13 载体的功能 l 运送外源基因高效转入受体细胞 l 为外源

7、基因提供复制能力或整合能力 l 为外源基因的扩增或表达提供必要的条件 Date l14 三、基因克隆的操作 1、从复杂的生物有机体基因组中，经过酶切 消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基 因的DNA片段； 2、在体外，将带有目的基因的外源DNA片段连 接到能够自我复制的并具有选择记号的载体分 子上，形成重组DNA分子； Date l15 3 3、感受态细胞的制备氯化钙法 第一次摇菌第一次摇菌 第二次摇菌第二次摇菌 离心收集细菌离心收集细菌 0.1M 0.1M CaCl2 重悬细胞 , 冰浴30 min 离心、重悬重复一次 Date l16 4、转化（transformation） 感受态细

8、胞与连接产物轻轻混匀, 冰浴30 min， 42水浴热激6090 s，快速冰浴2 min加 液体LB振荡培养，使细胞复苏。 Date l17 5、筛选（screening） 根据重组载体的表型 抗药性（Ampr 、Tetr） 其他mark（ -互补筛选） 根据DNA限制酶的酶谱分析 PCR反应 Date l18 基因克隆流程示意图 Date l19 带有负电荷的DNA或RNA核苷酸链，依靠无 反应活性的稳定的介质（琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺 凝胶）和缓冲液，在电场中以一定的迁移率从负极 移向正极。根据核酸分子大小不同、构型的差异， 以及所带电荷的不同，可以通过电泳将其混合物中 的不同成分彼此分开。

9、 一、核酸的凝胶电泳 （一） 基本原理： 第二节 DNA基本操作技术 Date l20 电泳迁移率：电泳分子在电场作用下的迁移速度 。 与电场强度和电泳分子所带的净电荷成正比。 与分子的摩擦系数成反比，摩擦系数是分子大小 、极性及介质粘度的函数。 支持介质：稳定，无反应活性； Date l21 （二）种类 1) 按凝胶材料分: 聚丙烯酰胺凝胶和琼 脂糖凝胶电泳 2) 按电泳装置分: 水平式/琼脂糖凝胶; 竖式/聚丙烯酰胺凝胶 3) 两种方法比较：分离效果和分离范围 ; 操作难易 Date l22 琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖是从红色海藻产物琼脂中提取的一种线 性多糖聚合物。将琼脂糖粉未加热到溶点后凝

10、固 ，便会形成良好的介质，其密度由琼脂糖的浓度 所决定。 特点：分辨能力低，但应用范围广，适用于较大 分子的分析。适于分离 200 bp 50 kb 的 DNA 片段。操作简便。 Date l23 Date l24 聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶是一种人工合成的凝胶，由 丙烯酰胺单体和交联剂甲叉双丙烯酰胺在催化剂 过硫酸铵和加速剂 TEMED ( 四甲基乙二胺） 的 作用下聚合而成。 聚合时，由单体丙烯酰胺聚合成链状物，由 交联剂甲叉双丙烯酰胺将链与链交联成网状，形 成立体的不溶于水的凝胶。 Date l25 特点：分辨能力高，但应用范围小，适用于较小 分子的分析。适于分离 5 bp 50

11、0 bp 的 DNA 片段。操作复杂。 核酸分子的染料 溴化乙锭（EB），因具有扁平分子的空间结构 ，能插入到 DNA 分子或 RNA 分子的相邻碱基之 间，并在300nm 波长的紫外光照射下发出荧光。 Date l26 （三）（三） 用途用途 琼脂糖凝胶用于DNA和RNA的常规分析；聚 丙烯酰胺凝胶常用于小分子核酸分析。 （四）（四） 凝胶电泳的一般程序凝胶电泳的一般程序 制胶 点样 电泳 染色 观察 Date l27 Date l28 Date l29 二、细菌转化 l细菌转化（transformation）是指一种细菌菌 株由于捕获了来自另一种细菌菌株DNA而导致 性状特征发生遗传改变的

12、生命过程。提供转化 的DNA菌株叫供体菌株，接受转化的DNA菌株 叫受体菌株。 l目前常用的转化方法有CaCl2法(化学转化法)和 电转化法。 Date l30 感受态细胞的制备氯化钙法 第一次摇菌第一次摇菌 第二次摇菌第二次摇菌 离心收集细菌离心收集细菌 0.1M 0.1M CaCl2 重悬细胞 , 冰浴30 min 离心、重悬重复一次离心、重悬重复一次 Date l31 转化转化（transformationtransformation） 感受态细胞与连接产物轻轻混匀, 冰浴 30分钟， 42水浴热激6090秒，快速 冰浴2分钟加液体LB振荡培养，使细胞复 苏。 Date l32 三、 P

13、CR基因扩增 聚合酶链式反应（polymerase chain reaction ) ，即 PCR 技术，是一种在体外快速扩增特定基因 或DNA序列的方法。 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis 等人发明了聚合酶链反应（PCR）,随 后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自 动化热循环仪 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝 尔化学奖。 Date l33 PCR特异性，即所扩增片段是由两个人 工合成的引物序列决定的。 Date l34 PCRPCR反应原理反应原理 变性 退火 延伸 Date l35 反应体系的成分 耐热的DNA聚合酶 PCR反应的缓冲液 Mg2+ Tri

14、s Cl 引物 d NTP 模板 DNA Date l36 温度循环参数 q 变性：双链DNA分子加热分离成两条单链 DNA分子的过程。 变性温度：是指双链DNA分子50发生变性时的 温度，一般为9495 Date l37 q 退火：两引物分别与两条DNA的两侧序列 特异性互补，形成双链的过程称为退火。 退火温度一般在5065 之间，具体温度与引 物长度、碱基组成以及浓度有关。 Date l38 q 延伸：在适宜条件下，DNA聚合酶以单链 DNA为模板，以4 种脱氧核苷三磷酸（d NTP )为 底物 , 在引物的诱导下，按 5 3方向复制互补 DNA的过程。 延伸温度一般为7075 ，此时DN

15、A聚合酶活 性最高。 Date l39 时间参数 q 变性时间：决定于DNA的复杂性，一般选取 94 1 min, 因过长的高温时间，会降低DNA 聚合酶的活性； q 退火时间：一般情况下取30 s1 min，因为 引物比较短； q 延伸时间：根据扩增片段的长度而定，一般 在 1kb 以内的片段需延伸 1min , 更长的片段需 相应延长时间。 Date l40 引 物 1、引物长度在15 30 bp 之间， 引物的退火温度 Tm = 4(G+C) + 2(A+T) 2、碱基随机分布 避免一连串相同碱基，引物本身不应存在互补 序列，两条引物间也不应有互补性，尤其是3端 ； Date l41 3、G + C含量 G + C含量一般为40 60 4、引物3端碱基的特异性。 Date l42 PCR技术的特点 ： 第一，特异性强 第二，效率高 第三，灵敏度高 1. 皮克(pg=10-12)量级扩增到微克(ug=10-6)水 平 2. 能从100万个细胞中检出一个靶细胞 第四，对标本的纯度要求低 u血液、体腔液、洗嗽液、毛发、细胞、活组 织等组织的粗提DNA Date l43 Date l44 四、实时定量PCR 实时定量PCR技术：指利用带荧光检 测的PCR仪对整个PCR过程中扩增DNA的 累积速率绘制动态变化图，利用