《褪黑素对海马ca1神经元外向延迟整流钾电流的作用及其机制》由会员分享，可在线阅读，更多相关《褪黑素对海马ca1神经元外向延迟整流钾电流的作用及其机制（76页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、复旦大学 博士学位论文 褪黑素对海马CA1神经元外向延迟整流钾电流的作用及其机制 姓名：侯尚伟 申请学位级别：博士 专业：神经生物学 指导教师：孙凤艳 20040501 A C S F A A A D D M S O 5 H T 5 H T P I K I A T E A T T X T r D T P O H V E G F 缩略词表 a r t i f i c a lc e r e b r o s p i n a lf l u i d a r o m a t i ea m i n oa c i dd e c a r b o x y l a s e d i m e t h y l s u l
2、 f o x i d e 5 一b y d r o x y t r y p t a m i n e 5 - h y d r o x y t r y p t o p h a n o u t w a r d d e l a y e d r e c t i f i e r p o t a s s i u m o u t w a r dt r a n s i e n tr e c t i f i e r p o t a s s i u m t e t r a e t h y l a m m o n i u m t e t r o d o t o x i n t r y p t o p h a n t
3、r y p t o p h a nh y d r o x y l a s e v a s c u l a re n d o t h e l i a lg r o w t hf a c t o r 人工脑脊液 芳香族氨基酸脱羧酶 二甲基亚砜 五羟色胺 五羟色胺酸 延迟外向整流钾电流 瞬态外向整流钾电流 四乙基胺 河豚毒素 色氨酸 色氨酸羟化酶 血管内皮生长因子 中文摘要 褪黑素对海马C A l 神经元延迟外向整流钾电流的作用及其机制分析 褪黑素( m e l a t o n i n ) 是一种主要由脑内松果体合成和分泌的神经激素， 离体和在体实验均已证实褪黑素具有强大的神经保护作用，主要机制在于
4、其 清除自由基和抗氧化功能。钾离子通道对于维持细胞膜兴奋性和神经元阳J 的 信息传递有着重要的作用。然而，近年来研究发现，延迟外向整流钾离子通 道( I K ) 活性增加参与了脑缺血后神经元的死亡过程。而其特异性通道阻断剂 具有神经保护作用。海马是中枢神经系统记忆和认知形成和巩固的重要结构， 同时也是缺血缺氧极易累及的脑区。己有的电生理学实验已经表明，褪黑素 可以调节海马神经元的兴奋性和突触可塑性。然而，褪黑素是否能调节海马 神经元I K 尚未见报道。因此，本实验采用脑片全细胞膜片钳记录技术，观察 了褪黑素对出生后1 4 1 8 天S D 大鼠海马c A l 锥体神经元I K 的作用，并分析
5、了其可能的机制。结果显示： ( 1 ) 为了研究褪黑素对I K 的作用，我们将细胞膜电位钳制于一5 0 m V ， 在一1 1 0 m V 的前置脉冲电压之后插入一段时间为5 0 m s ，幅度为5 0 m V 的中 间电压，使I A 完全失活，然后使膜电位去极化至l J + 6 0 m V 记录到I K ，在此基础 之上，我们观察了褪黑素对I K 的作用，发现褪黑素可以剂量依赖地抑制I K ， 其半数抑制剂量( I C 5 0 ) 为3 7 5 m M ( n = 8 ) 。从褪黑素对I K 作用的时程曲线可 以看到，褪黑素发生作用较迅速且具有可逆性，一般在绍药后1 分钟内起效， 在冲洗后6
6、 分钟恢复到给药前水平。 5 - H T 。如前所述，这些化合物都含有吲哚这一基本结构， 所不同的是吲哚上的侧链的极性不同而造成了脂溶性的不同。它们对I K 抑制 效应的差别恰恰反应了与这些化合物本身的脂溶性有很大的关联。为此，我 们设想，把脂溶性最小的5 - - H T 导入细胞内，也可能出现对I K 的抑制效应。 结果显示，电极内给予2 5 m M 的5 一H T 可以迅速抑制I K ，在给药后5 分钟， I K 的幅度降低为刚形成封接时幅度的5 7 7 5 2 4 ，同对照组的9 4 3 1 O 相比，P 5 - H TT h e s ei n d i c a t e dt h a t
7、t h ed i f f e r e n c eo fe f f e c t so fa b o v ec h e m i c a l sw a sr e l a t e dt ot h e i rd i f f e r e n tl i p o p h i l i c s o l u b i l i t y I t i sr e a s o n a b l et o p r o p o s et h a t 5 - H T ，w h i c hh a st h el e a s tl i p o p h i l i c s o l u b i l i t ya m o n gt h ea b
8、 o v ec h e m i c a l s ，c o u l dp r o d u c et h ei n h i b i t o r ye f f e c to nI Ki f i tw a si n t r o d u c e di n t ot h ec e i l s W ef u r t h e ro b s e r v e dm ee f f e c to f5 - H Ta f t e ri tw a s i n c l u d e di n t ot h e p i p e t t e s o l u t i o n T h er e s u l t ss h o w e
9、dt h a tt h er e l a t i v ec u r r e n t a m p l i t u d ew a s5 7 7 2 4 a t5m i na f t e rt h ea p p l i c a t i o no f2 5m M o f5 - H T ( P 0 0 5 ( o n e w a v A N O V A ) ( 图8 ) ，在此基础上，我们进一步观察了褪黑素的作用， 结果显示5 0 0 p M 的5 - - H T 不影响2 5 m M 的褪黑素对I K 的抑制( 图8 一D ) 。浚 结果提示褪黑素对I K 的抑制与5 - - H T 受体无关。 6
10、，H 2 0 2 可以剂量依赖性地抑制I K 为了研究褪黑素对I K 抑制的机制是否与其清除自由基的功能有关，我们 观察了H 2 0 2 对I K 的作用，结果显示，在给予0 0 1 ，0 1 ，l ，和4 r a M 的H 2 0 2 后，I K 的幅度分别为给药前的9 6 8 5 7 ( n = 6 ) ，9 5 4 4 - 5 1 ( n = 6 ) ，8 6 5 4 2 ( n = 5 ) ，和4 4 2 3 4 ( n = 5 ) ( P 5 H T ( 图1 2 ) 。提示褪黑素对I K 的作 用不仅与其特异的结构吲哚有关，而且也与其高脂溶性有一定的关系。 8 褪黑素与l K 的作
11、用可能发生在细胞内 6 为了证实吲哚与I K 的作用位点在细胞内，我们把5 - - H T 加入到电极内液 中观察其划l K 的效应，结果显示，5 一H T ( 2 5 m M ) 可以快速地抑制1 K ( 图1 3 一A ) ，在封接后5 分钟，I K 幅度为刚形成封接时幅度的5 7 7 5 2 4 ( n = 8 ) ， 同对照组的9 4 3 1 O ( n = 1 4 ) 相比，P 0 0 0 1 ( 图1 3 一B ) 。该结果提示 褪黑索与1 x 的作用可能在细胞内部。 4 0 2 0 0 2 0 - 4 0 6 0 ( m V ) F i g 1 N o r m a la c t
12、i o np o t e n t i a l se v o k e db yad e p o l a r i z i n gc u r r e n tp u l s e ( 5 0p A i n t e n s i t y ) i nat y p i c a lh i p p o c a m p a lC A lp y r a m i d a ln e u r o n ，一一曼2 1 1 1 旦! 一 蔺瓣翮盯一 少一瓦涵而r 一b 厂m _ ，。 一 枷m vh 4 l F i g 2T y p i c a lc u r r e n tt r a c e sr e c o r d e df
13、r o mo n eC A I p y r a m i d a ln e u r o ni n t h e a b s e n c ea n dp r e s e n c eo fd i f f e r e n td o s e so fT E A T h ev o l t a g e p r o t o c o l w a s d e m o n s t r a t e db e l o wt h ec u r r e n tt r a c e s 1 8 f B 1 0 0 孚9 0 o S8 0 7 0 O r 1 0 0 零 苫5 0 o D r C 0 T i m ef m i n
14、) 234567 - L o g m e l a t o n i n ( M ) F i g 3M e l a t o n i nr e v e r s i b l ya n dd o s e d e p e n d e n t l yi n h i b i t sI K A ：R e p r e s e n t a t i v e c u r r e n tt r a c e ss h o w i n gt h ee f f e c to fm e t a t o n i , n ( 2 ，5r a M ) 0 nI K B ：T i m ec o u r s eo f t h ee f f
15、 e c to fm e l a t o n i n ( 2 5m M ) o n 糸1d e n o t e st h eb e g i n n i n go f a p p l i c a t i o no f m e l a t o n i no rv e h i c l e ( + P O 0 5 ，+ + P O 0 1 ，a n d + + + P 0 0 0 1 ) C ：T h e d o s e - r e s p o n s e c H r v eo fm e l a t o n i no n I K 1 9 o A 一尹一 蓬 彳 C f ；：；i ；兰；习M 。，。，。
16、；。M 且匿 - s O Vh I 著e 4 ：M C o 出n t r 。o l i 。 割4 2 夕 l卢 要1Z 警，一。 l 。J 一夕。 B 8 6 4 2 0 莓0 - 4 0 - 2 002 04 08 0 V o l t a g e ( m V ) 一6 0 享 一 54 0 爱 是 2 0 - 0 01 02 03 04 0S 06 0 V o l t a g e ( m V ) F i g 4 E f f e c t so fm e l a t o n i no nt h e c u r r e n t v o l t a g er e l a t i o n s h i p o fI K A ： R e p r e s e n t a t i v ec u r r e n tf a m i l i e so f
