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1、学校代码： 10289 分类号： Q814.9 密 级： 公开 学 号： 112300016 微 流 控物催生江 苏 科 技 大 学化术技 硕 士 学 位 论 文酶 促 合 成 天产然微流控生物催化技术物增的 酶促合成天然产物的增效机理研究研究生姓 名 顾双双 导 师 姓 名 王 俊 申请学位类别 理学硕士 学位授予单位 江 苏 科 技 大 学 学 科 专 业 生物化学与分子生物学论文提交日期 2014 年 4 月 25 日 研 究 方 向 生物化学与生物资源 论文答辩日期 2014 年 6 月 8 日 答辩委员会主席 唐玉斌 教授 评阅人 盲 审 效 机 理 研 究顾 双 双江 苏 科 技大
2、2014 年 6 月 11 日学分类号： Q814.9 密级：公开 学号：112300016理学 硕士学位论文微流控生物催化技术酶促 合成天然产物的增效机理研究学生姓名顾双双指导教师王俊 副教授江苏科技大学 二 O 一四年六月A Thesis Submitted in Fulfillment of the Requirements for the Degree ofMaster of ScienceSynergistic mechanism of microfluidic biocatalysis technology used in the enzymatic synthesis of na
3、tural productsSubmitted by Gu ShuangshuangSupervised by Associate Professor Wang JunJiangsu University of Science and TechnologyJune, 2014江苏科技大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重 要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声 明的法律结果由本人承担。学位论文作
4、者签名：年月日江苏科技大学学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文 被查阅和借阅。本人授权江苏科技大学可以将本学位论文的全部或部分内 容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存 和汇编本学位论文。本学位论文属于：(1)保密，在年解密后适用本授权书。 (2)不保密。学位论文作者签名：指导教师签名：年月日年月日摘要摘要微反应器由于具有传质传热快、反应得率高、操作安全、易于放大等特点，可实 现高效快速地酶促反应，在生物催化领域开始崭露头角。然而，利用微反应器进行微 流控生
5、物催化技术合成天然药物的研究一直未见报道。因此，本文以酶促合成异槲皮 苷和咖啡酸苯乙酯这两种珍稀的天然药物为研究对象，研究在微反应器中连续流和分 段流模式的微型生物催化技术及其过程机制，对于高效制备高附加值天然药物具有重 要意义。主要研究结果如下：构建了连续流微通道式反应器内橙皮苷酶选择性催化水解芦丁合成异槲皮苷的新 方法。研究微通道长度、酶浓度、底物浓度及温度等因素对酶促反应的影响。当芦丁 浓度 1 g/ L、酶浓度 0.1 g/mL、温度 40 、流速 2 L/min 时，异槲皮苷最大得率为 98.6%，最大产率为 3.23 M/min，酶的表观活化能 Ea 为 4.61 kJ/mol。与
6、间歇式反应 器相比，反应时间由 10 h 骤减至 40 min，速率提高了 16.1 倍。基于新颖的“缓冲液-离子液体/溶剂”反应-分离耦合新体系，构建了分段流多通 道式微反应器内橙皮苷酶选择性催化水解芦丁合成异槲皮苷的新方法。采用单因素法 获得酶促合成异槲皮苷的最优工艺条件：当流速 4 L/min、底物浓度 2 g/L、酶浓度 1g/L、温度 30 时，异槲皮苷的得率高达 100%。与间歇式反应器相比，反应时间由 1h 缩短至 20 min，速率提高了 3 倍。这是由于互不相溶的“缓冲液-BmimBF4/三乙 酸甘油酯”两相在微管道内形成塞流，引起传质加剧。与单通道微反应器相比，应用 多通道
7、微反应器的单位时间产量由 0.076 g/min 提高到 0.439 g/min，提高了 5.7 倍。基于转酯化策略，构建了连续流微槽式反应器内脂肪酶催化咖啡酸烷基酯与苯乙 醇合成咖啡酸苯乙酯的新方法。在常规间歇式反应器中，筛选出最佳底物和催化剂分 别为咖啡酸甲酯和 Novozym 435；将其应用于微槽式反应器中，探索了酶促合成咖啡 酸苯乙酯的工艺条件，进而采用响应曲面法优化获得最适条件：当酯醇摩尔比 1:20、 温度 60 、流速 2 L/min、保留时间 2.5 h、咖啡酸甲酯浓度 3 mg/mL 时，咖啡酸 苯乙酯的得率高达 93.21%。与传统的间歇式反应器（24 h，66.4%）相
8、比，反应时间 缩短至原先的 1/10，得率提高了 26.8%。利用密度泛函理论（DFT）和反应动力学模型对酶促合成咖啡酸苯乙酯的过程机 制进行了初步探索。结果表明，咖啡酸甲酯相对于其他咖啡酸烷基酯而言，具有更长 的键长和能量而成为最适的转酯化合成底物；在连续流微槽式反应器内酶促转酯化合 成咖啡酸苯乙酯的反应动力学符合 LillyHornby 模型，当流速为 2 L/min 时动力学常 数 km为 14.04 mM；而在间歇式反应器中，酶促酯化和转酯化合成咖啡酸苯乙酯的反 应过程均符合醇抑制的乒乓模型。因此，利用微流控生物催化技术酶促合成珍稀天然药物具有常规反应器所无法比I江苏科技大学理学硕士学
9、位论文拟的过程强化优势，大大提高了产物的时空合成效率，并可通过并行放大来提高产量， 对于今后高附加值天然药物的高效酶促合成具有潜在的应用前景。关键词 生物催化；连续流；分段流；微反应器；异槲皮苷；咖啡酸苯乙酯IIAbstractNowadays, microreactors have shown promise as a novel method in biocatalysis. These have some advantages such as rapid heat and mass transfer rates, higher yield, safely operation and ea
10、sily enlarge, which can realizes highly efficient and rapid enzymatic synthesis. However, no report has been published concerning microfluidic biocatalysis technology used in enzymatic synthesis of natural product ingredients. Thus, based on enzymatic synthesis of isoquercitrin and cafffeic acid phe
11、nethyl ester (CAPE) which are both rare natural product ingredients, microfluidic biocatalysis technology and process mechanism of continuous flow and segmented flow patterns in microreactors were investigated, respectively. It has important significance for high-efficient production of high-value n
12、atural product ingredient. The concrete results were as following:Anovelcontinuousflowbiosynthesisofisoquercitrinusingthe hesperidinase-catalyzed selective hydrolysis of rutin in a microchannel reactor was establishsed. The effects of channel length, hesperidinase concentration, rutin concentration
13、and temperature on isoquercitrin yield were studied. The maximum isoquercitrin yield (98.6%) was achieved under the optimum conditions as follows: rutin concentration of 1 g/L, hesperidinase concentration of 0.1 g/mL, reaction temperature of 40 C, and flow rate of 2 L/min. The activation energy valu
14、e (Ea) of the enzymatic reaction was 4.61 kJ/mol. Compared with a batch reactor, the reaction time was shorten from 10 h to 40 min, and the reaction rate was increased by 16.1-fold.Based on a new system of reaction coupling with separation, a novel segmented flow containing “buffer- ionic liquid/solvent” in a multi-channel microreactor was applied to synthesize isoquercitrin by the hesperidinase-catalyzed selective hydrolysis of rutin. Using the developed segmented flow microreactor, the process condit
