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1、枣謇畜牧兽医学会动物繁殖学分会第十三属学本研|寸会论文集蚓激酶基因在牛乳腺中的表达2刘殿峰张嘉保1张守峰2姚伟1扈荣良2(1吉林大学实验动物中心，吉林长春130062：2军事医学科学院军事兽医研究所，吉林长春130062)捅要：将含有蚓激酶基因的表这盒插入到逆转黎病毒载体pLNCL中获得了蚓激酶重组逆转录病毒载舔，转染泌霉乙期奶牛乳腺小呻并获得暂对表达。利用脂震俸转染PA317包装细胞，G418进行筛选得到了阳性细胞克隆，克隆扩大培养后病毒上清感染NIH3T3细胞进行滴度测定，最高滴度为1104CFUml。进而用病毒上清转染妊娠期奶牛乳腺小叶组织，产后奶样经FAPA法检测表明翦l激酶基因已经整
2、合到奶牛乳腺组织，并能实现相对稳定的表达。关键词：蚓激酶；重组逆转录病毒；包装；转染；表达自Gordon等fl】人首次应用转基因技术在哺乳期小鼠的乳腺中表达出入组织源性纤溶酶原激活荆以来，通过转基因动物技术制造乳腺生物反应器生产重要的药熏蛋自的优越性和可行性几乎已达成共识，但在临床I期或II期的试验中的转基因动物的产品却很少。尽管如此，通过转基因技术生产药物仍然展示了良好的前景。蚓激酶(1umbrokinase，LK)作为一种新型的溶栓药物正在广泛应用于心脑血管病的治疗，健西前临床所需的毛K均是扶夷蠡鲟|体内壹接提取，其制备工艺繁杂，产壁较低。因面通过基因工程手段生产大量窿纯度的LK已成为一种
3、极有前景的途径。逆转录病毒介导的基因转移技术是80年代初建立起来的高效基因转移方法，它借助逆转录病毒DNA载体与外源基因重组后经包装细胞系产生缺陷性重组逆转录病毒，该病毒可以成功邋感染靶细胞，将外源基因整合予染色体基因组中，并褥以在靶细胞中表达。本试验以逆转录病毒为载体将蚓激酶基因转入奶牛乳腺组织进行了蚓激酶表达研究，为建立蚓激酶乳腺生物反应器及转基因奶牛奠定了基础。1材料与方法11质粒、菌种和细胞含目的基因蚓激酶(Lumbrokinase，LK)基因的质粒pMDl8T-LK、pcDNA3、pGEMT-bCP及逆转秉病毒载钵pLNCL、EcoliDH5a菌株和双嗜性包装细施系PA317由本室保
4、存；NIH3T3缨胞系由哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室孟庆文博士惠赠。12分子生物学试和基因工程工荚酶购皇大连宝生物公司；纾维蛋是原(F)和凝巍酶(室)购自中国药品生物制品鉴定所(北京)；转染试剂LipofectamineReagent购自Invitrogen公司；胰蛋白酶，小牛m清，DMEM培养基，G418购自SIGMA公司。13实验动物健康奶牛8只，23胎泌乳期2头，怀孕7个月奶牛6头，由长春华春肉牛集团提供并饲养。14DNA的常规操作质粒DNA韵提取、感受态的制备、DNA究隆、连接、束端修饰、转化帮鉴定等揉作按分子壳隆实验指南瞄】进行。15蚓激酶重组逆转录病毒载体的构建以pc
5、DNA3、pGEMT-bCP、含人工合成蚓激酶eDNA的质粒pMDl8T-LK及重组逆转录病毒载体pLNCLacZ为原始质粒，构建含蚓激酶的重组逆转录病毒表达载体。见图l。2基金项目：国家“863”高技术研究发展计划(No2002AA206653)基金资助终纛楚分：刘殿峰(1963)男，在读媾，副教授，主要从事实验动物遗传育种与转基因动物方匿豹研究工作。宰联系人；刘殿峰，Email：ccldf163com；电话：04317836553巾爨喜羲簧黢学会澳物繁蓬学努会第十纛疆学术研讨会论文豢耀鲠粒pLN-bCP-LK鞴建繁臻Fig1ConstructionofplasmidpLN-bCPLK16蚓
6、激酶在泌乳期奶牛骢腺的错时表达161转染奶牛莪腺熏簌织将500rig重组质粒溶解在20ml灭菌生理盐水中，全部注射入一只泌乳期奶牛右侧后乳头中，采繁涟射蘸的对照奶样和注射鼯3h，6h，9h，16h，23h，30h，54h，78h奶样，共注射两只奶牛。16。2蓠|激酶活栏检测采用纤维蛋自平板溶圈法(FibrinAgarosePlateAssayFAPA)，参考文献疆1介绍的方法进行。将转染前后取赡奶样12000rpm，离心5min，取中耀的乳清层。FAPA板酶簿孔加入2qul奶样；将平板放予湿盒内37。C溢育18h。17脂质体奔导的瓣激黼重组逆转录病毒载体转染PA317细胞转染嚣天，用胰酶消化攀
7、艨细胞，CO：培葬箱遍培养过夜至缨胞长满如锡一80；转染蓠爝不含盥清纛抗生索的DMEM培养液洗缁臆三次，以除去可麓残筮靛盘清和抗生素。戳上述DMEM分剃将5lag质糍DNA和40plLipofectamine稀释至250pl，等体积混匀后室温下静鬣感作3045min，使之形成复合物；补热2nd上述瑚垭M稀释复会物鹾趣入细胞培养扳内，置37培养；1211后倾弃转染液并加入4ml含lOd串巍漓和适量抗生素的培养液继续培养，至细胞恢复良好生长状态。审鬻畜牧羲医学会韵镌繁殖攀努会第十兰鼷学术礴讨会论文集IIIIIIIIIIIIIIII!IIII!III!I!III!I!糕18G418抗性缨勰戆簿选转染
8、螽鳇PA317缨魏在37，5C02饱和漫度培养36h着，将纲魏按1：10分健入6魏板书，培养12h特细胞贼壁后，加入大予最小致死剂量G418的DMEM营券液继续培养。每三天换一次液，大约14天，可见缨胞竟隆。：19产毒缨施瀚扩大培葵在越净工作螽上用无菌拖头挑取细臆竟隆，移入96魏板，长满赠，依次传入24孤板，6孔缀，30ml帮50ml细腮培养瓶，逐步扩大培养。王。lO蚓激酶重组逆转录病毒麓滴度测定参考藉编分子生物学实验指港莲】分缮馥方法进行。l。l羔蚓激酶在泌乳期觌牛乳艨的稳定袋达i。11I转染奶丰戴艨缎织璐逆转录病毒壤养液鼬畦注射簸娠了个弼娆牛乳头转染巍艨缀织，产犊蘑每孀深奶襻一次低温存放祷
9、检。l。lI。2鲻|激酶活挂检测按16。2方法进行。2。结粜2。羔蚓激酶重组逆转暴病毒载体翡酶嘲鉴定结暴蔫Not五PvuIIScaL酶讶pBLK，用Eag霸Sph舂XbaI酶切pLN-bCP-LK，结果与预期一致。见圈2黼2覆犍pBLK窝pL淞b鼯嚣辩窃鬟定缀巢羰蛰2IdentificationofrecombinantplasmidspBLKandpLN-BCP-LK1pBLKNotI2pBLFJPvu3pBLKSca磊4pBLK5pTl31Hind111Marker6pLN-bCP-LK7pLN-bCPLKEag磊8pLNbCP-LKISph毛9pLN-bCP-LKXbaI22PA317摭
10、性克隆的形成经Lipofectamine介导游pLN-bCP-LK重组璇粒转染PA317鳃勰并焉G418筛选的黧S天凄瑰麓亡，8一lO天死亡暌显，虽黻正常对照组为甚；纂14天，备转染缀邑长鑫大小不等麓维胞竞隆，澎态良好；面对照缒无克隆形成且已绝大部分死亡，说聪转染成功。宠隆孛瘸毒最高滴度豹先l104CFUml。23蚓激酶活性梭测绻果FAPA法检测结果表明奶牛乳腺缎织在注鸯寸霆缀质粒嚣，9h、16h蚓激酶的表达量达羹|最高德，试验持续78h；熏缎逆转录瘸毒转染乳腺组织，奶牛产犊籍娆孛鲻激酶可持续表达112d，觅整3、图4。3。讨论本鹾究选择豹逆转录瘸毒载俸LNCL属于学架必MoMLV的藏簿系残，
11、标记基因淹薪霉素磷酸转移酶II(NPTII，套沱oR魅因)，该酶对氨基糖裁类抗麓索G418鼹毒抗性，经NeoR基因转导的缨中国蛮牧兽医学会动物繁殖学分会第十兰瘸学术硪时会论文巢胞能在含G418的培养液中生长嘲。选用的包装细胞系PA317，含有逆转录病毒PAM3基因组，除1lr信号缺失外，5LTR部分缺失，3LTR被SV40的polyA信号取代，这种包装结构与载体结构至少要经过二次独立兹重缀才能形成有复制麓力瓣野生型瘸毒，安全性赛，丽显PAM3豹erlv来藩4070A双嗜性逆转录病毒，可产生双嗜性病毒颗粒，从而扩大了病毒的寄主范围【7】。采用LipofectamineReagent进行转染，其表
12、面带有正电荷，可以通过静电作用尚带有负电荷的DNA或RNA结合，对DNA片段大，、没有限制，扶两提高了核酸运载效率帮转染效率。豳3：注射鲎缎质粒后奶样FAPA检测结果，图4：奶牛盎壬娠期注射麓组病毒产靥奶样FAPA检测结果，从从发鸯右，A1：阳性对照，A2：臻性对爨，B，0分戥蠹嚣裹皇右，A楚隰性对照，A2阴性对照，8。8隽产后每瓣炙奶牛3氧翱9h16h23h30h54h78h注象嚣警辩蠲携一次共6阁奶祥Fig3ResultofFAPAafterinjectingrecombinantplasmidsFg4ReeutofFAPAafl：ernjecl：ingrecombinantA1，posi
13、tivestandard；A2negativesample；B1-8，CI一8，samplesrel：rovlrUerespectivelyfromtWOCOWSat3h，6h，9h，16h，23h，30h，54h，AI，positives1：andard；A2，negal：ivesample；81-16。and78hafter蠲ecfing试验孛，我餐在蚓激酶基因豹上游插入了出羊酪蛋鲁基因(t3-casein)5嚣调控挚YrJ(BCP)。BCP作为乳腺特异性启动子能指导目的基因在乳腺组织实现高效表达，经产物活性检测结果得以证实；将重组袋粒注射泌乳絮奶牛巍腺后蝴激酶在奶中实现了表达，试验连续接
14、样至78小时仍鑫基表达，组随时麓交化表达量先升高嚣降低直至消失。其原因在于掰l激酶基因虽然进入乳腺组织但未能整合，随时间延长质粒将会被降解；将熏组病毒转染乳腺组织后，产后奶中同样有蚓激酶的表达，经FAPA法活性检测表臻其表达量较低，健可维持较长时翔且表达水平相对稳定，试验显示连续表达112天，对闼延长纤维蛋自溶躺略有减少趋势。其原因可能怒由于随时闻延长，牛犊逐渐断奶，对奶牛乳腺的刺激随之减少，从而导致其乳腺组织代谢水平降低，奶量减少的同时其中蛋白的表达水平随之降低。试验证嗡用揍繁外源基因的逆转录瘸毒来感染动物组织可以实现基因匏转移，并能发生稳定整合，使动物组织长勰袭达井源蒺因，这为转基因动物的
15、建立奠定了良好的基础。参考文献1)Gordon，K，ELeeJAVital。1987，ProductionofhumanplasminogenactivationintransgenicmicemillBiotechnology5(11)：1183-1187。赫萨姆毒簧克j、EF嚣里毒、零曼尼陲蒂巍，1992分子态隆实验措寓筹二黻)金冬疆、黎孟援译。魏索：辩学出版社。17，55。3)张守峰、息荣良、赵瓣、李敏，2002，tPA体外纤溶活性及半定量检测方法的确立。中国替医学报，22(5)：436-437铘奥蘩麴瓢R毒稔特、RE金颧顿、DD穆尔、埯塞德曼、王庭史密瓶、K簸特控零，1998，鞲续分子生物学实验指南(颜予颖、王海林译)。北京：科学出敝襁，319320。5)张守峰、扈荣良、赵糟，2000一个改进的DNA分子量标准物硼13HindlHMarker。中圈兽医学报20(6)：61i。彤吴乃虎，2002基嚣王程嚣莲(下瓣)。=ll：京：科学窭舨社，338。340。7)MillerAD&G，Rossman1989，Improvedre：oviralvectorsforgenetransferandexpressionBiotechrdques，7(9)：98()-990。
