生殖毒性试验与评定

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1、一、 生殖毒性试验与评定 二、发育毒性试验与评定 一、生殖毒性试验与评定 外来化合物对生殖过程的损害作用，即生殖毒性。 生殖毒性可发生于妊娠期，也可发生于妊娠前期和 哺乳期。 生殖毒性试验主要研究外来化合物对生殖细胞发生 、卵细胞受精、胚胎形成、妊娠、分娩和哺乳过程 的损害及其评定。过去也称为繁殖试验。 生殖毒性试验的目的在于了解外源化学物及其代 谢产物对机体成年哺乳动物的生殖功能和生育力 的影响。 多代繁殖试验在整个生命期内接触受试化学物， 更符合人类实际生活中长期低剂量接触食品添加 剂、微量重金属、农药及环境污染物的情况。 （1）试验方法原则 生殖毒性试验多用性成熟大鼠，也可用小鼠或家 兔

2、。大鼠自然受孕率较小鼠为高，较为理想。 一般设三个剂量组，另设对照组。 最高剂量组剂量应该超过预期人类实际接触水平， 希望能使亲代动物出现轻度中毒，但不出现死亡或 死亡率不超过10%，也不能完全丧失生育能力。 低剂量组的亲代动物不应观察到任何中毒症状。 另设中间剂量组应仅能出现极为轻微的中毒症状。 中间剂量与高剂量和低剂量应呈等比级数。 动物接触受试物的方式应参照人类实际接触途径。 一般可混入饲料或饮水中，由动物摄取；也可采用 灌胃或胶囊法。 利用大鼠或小鼠进行试验时，每组雌雄各1620只 ，或雌性1620只，雄性810只。 （2）试验方法 三代两窝生殖试验 大鼠断奶或出生8周后，开始喂受试物

3、或以其 它方式与受试物接触，共进行812周，即直到 性发育成熟，相当出生后4个月左右。每周至少 称体重一次，记录进食量并观察有无中毒症状或 死亡。 将雌雄亲代动物（F0）同笼交配，雌雄比 例为11或21，直到受孕或进行3周为止。雌 鼠受孕后即单笼饲养，继续接触受试物。交配3 周后，如仍未受孕，则停止交配，并进行生殖 器官病理学检查。 确定是否受孕的方法是每日清晨进行雌性动物阴道涂片， 检查有无精子；亦可检查阴道有无阴栓出现，以确定受精 日期。小鼠阴栓可在阴道口存留较长时间，但在大鼠极易 脱落，次晨检查时往往在笼下粪便盘中检出。发现阴栓或 检出精子，即为受孕0日，也有作为受孕第1日。 亲代动物（

4、F0）所生仔鼠为第一代（F1）。出生后应检查每窝幼仔数、死 亡数以及肉眼可见幼仔畸形。出生后第4天和第21天逐个称取重量，仔鼠 断奶后，母鼠休息10天，再与雄鼠交配一次，并生出第二窝仔鼠，亲代共 生出仔鼠两窝，分别为F1a和F1b。F1b出生后，将雄性亲鼠淘汰，雌性亲 鼠继续喂受试物，直至F1b出生后21天断奶为止。F1a断奶后观察其发育情 况，不再喂受试物。F1b断奶后，继续接触受试物8 12周，直到性发育 成熟，选出雌雄各1620只，按前法进行交配。F1b所产第一窝幼仔为F2a ，F2a断奶后，其母鼠F1b休息10天，再次交配，所生幼仔为F2b，F2b断奶 后，将F1b淘汰。F2b交配处理

5、方法与F1b相同。但F2b也可只交配一次，所 产仔鼠为F3a，不再进行第二次交配，试验结束。 F F0 0 （断奶或出生周） F F b b F F a a F F b b F F b b F F a a F F a a 给予受试物8到12周 第一次交配 第二次交配 观察三个月，喂饲普通 饲料，观察其生长发育 情况 断乳后给予受试 物到周 观察三个月，喂饲普通饲 料，观察其生长发育情况 断乳后给予受试 物到周 F F0 0 （断奶或出生周） 2两代一窝和一代一窝生殖试验 近年来许多国家与机构多规定采用两代一窝或一代一 窝试验法。 两代一窝生殖试验法基本程序与三代两窝试验法相同 ，但只进行到第二

6、代F2，每代只交配一窝。 两代一窝生殖试验 F2断奶，检查发育情况 F2出生，每窝留只幼仔 F交配 断奶，给予受试物 F1（每窝选留幼仔只，雌雄各半） 第1619周 雌雄交配 出生第8周给予受试物（F0） 在上述各种生殖毒性试验中，根据哺乳动物全部 生育繁殖过程，可观察下列4个指标： 1受孕率反映雌性动物生育能力以及雌性动物受 孕情况。 受孕率= 100% 妊娠雌性动物数 交配雌性动物数 （三）观察指标 2正常分娩率反映雌性动物妊娠过程是否受到影 响。 正常分娩率= 100% 正常分娩雌性动物数 妊娠动物数 3幼仔出生存活率反映雌性动物分娩过程是 否正常，如分娩过程受到影响，则幼仔往往在 出生

7、4天内死亡。 幼仔出生存活率= 100% 出生后4天存活幼仔数 分娩时出生幼仔数 4幼仔哺乳成活率反映雌性动物授乳哺育幼 仔的能力。 幼仔哺乳成活率= 21天断奶幼仔存活数 出生后4天幼仔存活数 100% （四）结果判定 将试验组动物各项观察指标统计结果与对照组动 物进行比较，如试验动物在交配、妊娠、幼仔存 活、幼仔发育（哺育）等方面受到影响，则说明 受试物对动物繁殖功能有损害作用。 二、发育毒性试验与评定 1. 基本概念 发育毒性指出生前经父体和（或）母体接触外源 理化因素引起的在子代到达成体之前内出现的有 害作用，包括结构畸形、生长迟缓、功能障碍及 死亡。 能造成发育毒性的物质称为发育毒物

8、。 畸形：指出生前因素引起发育生物体的严重的解剖 学上形态结构的缺陷。 致畸性和致畸作用：均指在妊娠期（出生前）接触 外源性理化因素引起后代结构畸形的特性或作用。 变异：是由遗传和遗传外因素控制的外观变化，或 由于分化改变而引起的中途歧异。 2. 发育毒性的表现 生长迟缓 即胚胎与胎仔的发育过程在外来化合物影响下，较正常的 发育过程缓慢。 致畸作用 由于外来化合物干扰，活产胎仔胎儿出生时，某种器官表 现形态结构异常。致畸作用所表现的形态结构异常，在出 生后立即可被发现。 功能不全或异常 即胎仔的生化、生理、代谢、免疫、神经活动及 行为的缺陷或异常。功能不全或异常往往在出生 后一定时间才被发现，

9、因为正常情况下，有些功 能在出生后一定时间才发育完全。 胚胎或胎仔致死作用 某些外来化合物在一定剂量范围内，可在胚胎或胎仔发育 期间对胚胎或胎仔具有损害作用，并使其死亡。具体表现 为天然流产或死产、死胎率增加。 发育毒性研究的目的是通过计数胚胎或胎仔 吸收或死亡数，测量胎仔的重量和性别比， 检查外观、内脏和骨骼的形态，来识别受试 物有无对胚胎或胎仔的致死、致畸或其他毒 性作用。 最佳联合方案是对成年动物进行染毒并包括 子代从受精卵到性成熟所有生长发育阶段。 观察期应贯穿一个完整的生命周期，以 检测近、远期效应。 最常选用的方案为三阶段试验 。 三段生殖试验图解 生育力和早期胚胎发育毒性试验 胚

10、体胎体毒性试验（致畸试验） 出生前后发育毒性试验 I 阶段试验 雌雄交配前-受孕-雌性受精-雌性着床期 间染毒 研究对成年雌雄性的生殖功能、配子的 发生及成熟、交配行为、受精、着床前的 发育和着床的影响 阶段试验 从着床到硬腭闭合期间染毒 研究对成年雌性生殖功能、胚胎 发育、器官形成期的发育毒性 阶段试验 从着床到幼仔断乳期间对孕（乳）母染毒 从着床到子代性成熟的母体生殖毒性（妊娠、分 娩和哺乳）和子代的发育毒性（胚胎、胎儿生长 发育，新生幼仔宫外生活的适应性，断乳前后的 生长发育，独立生活能力和性功能成熟） 人、大鼠和家兔的致畸作用关键期的比较，短线表示“靶窗” 3. 发育毒性作用评价 发育

11、毒性主要表现为致畸作用，所以发育毒性作 用评价主要是评价受试物的致畸作用。 通过致畸试验可以确定一种受试物是否具有致畸 作用。致畸试验是检查受试外源化学物能否通过 妊娠母体引起胚胎毒性或后代畸形的动物试验。 胚胎在器官形成期，可因受到化学物或放射性物 质的作用，使细胞分化、器官形成和正常发育受 到阻滞，以致出现胎仔器官的器质性缺陷而呈现 畸形。 1. 母体效应: 受试物对母体产生了损害作用，从而影响 了正常妊娠，而不是对胚胎的直接损害。 2. 胚胎效应: 受试物对胚胎的直接损害作用。 3. 出生前胎儿效应: 出生胎儿出现外表或内脏畸形。 4. 出生后效应: 引起子代的生理功能或生理结构的缺陷

12、。如后天生长发育或生殖功能受影响。 致畸作用包括： 受试动物接触外源化学物的方式与途径应与人体实际接触情 况一致，一般多经口给予，雌鼠妊娠的第715天染毒，常用 灌胃方式。 试验期间每23天称取孕鼠体重。通过体重变化可观察受试 动物的妊娠情况和胚胎发育情况。 受孕鼠的体重如持续增长，则表示妊娠过程及胚胎发育正常 ；如体重停止增长或下降，可能由于受试物的毒性作用或母 体的其它原因，引起胚胎死亡或流产。 传统常规致畸试验 （1）动物选择 （2）剂量分组 （3）动物交配处理 （4）胎仔检查 （5）数据处理 （6）结果评定 （1）动物选择 致畸试验的动物选择，除参照毒性试验中选 择动物的一般原则（食性

13、和对受试物代谢过 程与人类接近，体型小，驯服，容易饲养和 繁殖及价廉）外，还应特别注意妊娠过程较 短、每窝产仔数较多和胎盘构造及厚度与人 类接近等特点。 根据上述原则综合考虑，致畸试验可选用二种哺乳动 物，一般首先考虑大鼠，此外可采用小鼠或家免。大 鼠受孕率高，每窝产仔810只，易于得到足够标本 数；而且经验证明，大鼠对大多数外来化合物代谢过 程，基本与人类近似，故可首先考虑。 小鼠自然畸形发生率较大鼠高，但低于家兔，对形成 腭裂的致畸物更较敏感。 家兔为草食动物，与人类代谢功能差异较大，妊娠期 不够恒定，有时延长至36天，自然畸形发生率也较高 。 （2）剂量分组 致畸试验中剂量分组的一般原则

14、是一方面要 求出最大无作用剂量，以及引起致畸的阈剂 量，同时还要保持母体生育能力，不致母体 大批流产和过多胚胎死亡，也应避免较多母 体死亡。 高剂量组：LD50的1/5或1/3。 原则是引起母体轻度中毒，死亡率10%; 低剂量组：LD50的1/301/100。 原则是不引起母体的任何中毒症状。 中剂量组：在高、低剂量之间成等比关系。 原则是只引起母体极轻微毒性反应。 或者以实际接触量为低剂量，以其10倍量为高剂量 。 （3）动物交配处理 将性成熟雌雄动物按雌雄l1或21比例同笼交配 。每日将已确定受孕雌鼠随机分入各剂量组和对照 组。 由于致畸作用有极为明确的敏感期，应精确掌 握动物接触受试物的

15、时间，必须在器官发生期 。如提前在着床前接触，将影响受精卵的着床 。如在胚胎发育的最初阶段，例如裂卵期和囊 胚期接触受试物，往往可使胚胎死亡，不能造 成畸形。如在器官发生期以后接触受试物，则 各种器官已发育成熟，致畸作用不易表现。 只有器官发生期的胚胎，对致畸物最为敏感， 易于出现畸形。 接触受试物的方式与途径应与人体实际接触情况 一致，一般多经口给予。 也可采用灌胃方式，以保证剂量准确，效果较混 入饲料喂给为好。在特殊情况下，也可采用腹腔 注射法，效果与经口近似。 试验期间每23天称取母鼠体重。一方面可根据 体重增长，随时调整给予受试物的剂量，同时也 可观察受孕动物的妊娠情况和胚胎发育情况。

16、受 孕动物的体重如持续增长，则表示妊娠过程及胚 胎发育正常；如体重停止增长或下降，可能由于 受试物的毒性作用或母体的其它原因，引起胚胎 死亡或流产。 （4）胎仔检查 鼠类有食畸形胎仔的习性，应在预期分娩前1 d2 d处死母鼠进行检查。 一般大鼠在受孕后第1920d，小鼠第1819d。 剖检前称量并记录母鼠最终体重。 常采用颈椎脱臼法或断头处死法处死动物。 从腹中线剖腹，暴露子宫和卵巢，为胎仔检查做 准备。 活产胎仔取出后，先检查性别，逐只称重，并按 窝计算平均体重，然后由下列几方面进行畸形检 查：外观畸形肉眼检查，例如露脑；肉眼检 查内脏及软组织畸形，例如腭裂；骨骼畸形检 查，例如颅顶骨缺损，分叉肋等。畸形检查只限 活产胎仔。 以上检查只能检出结构与形态异常的畸形，不能检 出可能发生的生化功能或神经行为缺陷。因此有人 主张将试验雌鼠保留1/4左右，待其自然