《荧光定量PCR技术在临床检测中的应用讲解》由会员分享，可在线阅读，更多相关《荧光定量PCR技术在临床检测中的应用讲解（92页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、荧光定量PCR技术在 临床检测中的应用 中山大学 中山医学院生物化学教研室 达安基因股份有限公司首席科学家 朱振宇 医学博士、教授、博士生导师 Tel：13922430138，02037656430 九十年代中期PCR临床应用在国内全面展开 1998年 荧光定量PCR技术开始在中国应用 于临床检测 PCR 发展简史 PCR (Polymerase Chain Reaction) 1983 Cetus 公司的 Kary Mullis于12月16日第一 次 成功实验发明了PCR 1985 关于PCR 的文章首次由 Kary Mullis及其同事 等人 在Science上 发 表 1989 12月S
2、cience杂志将PCR和它所使用的 Taq DNA聚合酶命名为第一个“年度分子”。 1993 Kary Mullis，Nobel Prize in Chemistry 1995 Perkin Elmer 公司研制出荧光定量PCR技术 循环次数 DNA的链数 1 21 2 2 22 4 3 23 8 10 210 1024 20 220 1,048,576 30 230 1,073,741,824 10亿 PCR循环次数与DNA产量关系 PCR循环 PCR特点：高效扩增、忠实复制 灵敏度高 快捷 简便 对样品纯度要求低 可以相对定量 PCR反应的特点 Ct值的意义 Ct值与重复性 同一样本在相
3、同条件下同时进行96次 扩增 FQ-PCR Ct值与浓度 不同的模板达到荧光域值时的Ct 值不同 感染性疾病的诊断感染性疾病的诊断 母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断肿瘤的诊断 法医学鉴定法医学鉴定 荧光定量PCR的临床应用 早期诊断早期诊断 病情评估和预后判断病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证新药验证 一 感染性疾病 1. 病原体含量与病情之间的关系 2. 病原体含量与用药之间的关系 3. 药物及疗法的研究与开发 4. 新的病原体分子诊断标准 5. 新的愈后指标 6. 传染病发病的监控、预测与预防
4、 临床应用 临床应用 二 肿瘤 1. 肿瘤标志物：癌胚抗原、同功酶、抗体、激素、细胞 因子、受体等 2. 肿瘤相关基因表达的检测：包括癌基因抗癌基因、肿 瘤转移基因及转移抑制基因 三 遗传病 1. 等位基因检测 2. 多基因遗传病的突变检测 3. 基因表达异常所致遗传病检测 荧光定量PCR在病原体检测中的应用 一 肝炎病毒定量检测 二 性病病原体检测 三 结核杆菌及呼吸道病原体检测 四 优生优育(TORCH)相关项目检测 临床应用 一 肝炎病毒定量检测 二HBV 三HCV 临床应用 （一） 乙型肝炎病毒结构及特点 HBsAg：是HBV感染的主要标志 HBsAb：保护性抗体 HBcAg：仅存于感
5、染的肝细胞核内， 一般不存在于血循环中 HBcAb: 非保护性抗体，HBcAb-IgM 提示HBV处于复制状态 HBeAg：HBV复制及强感染性的指标 HBeAb：有一定的保护作用，预后良好 HBV HBV （二） HBV-DNA与“两对半” 1. “1. “两对半两对半” ” ：机体的免疫反应状态；：机体的免疫反应状态； 2. “2. “携带者携带者” ”、“ “大三阳大三阳” ”、“ “小三阳小三阳” ”等免疫学指标不能等免疫学指标不能 反应体内病毒复制水平与感染程度。反应体内病毒复制水平与感染程度。 FQ-PCRFQ-PCR：检测的是检测的是HBVHBV本身的遗传物质本身的遗传物质DNA
6、DNA，是是 病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。病毒存在和复制的最可靠、最直接的指标。 3. 血清学指标()不能排除HBV感染。 HBV （二） HBV-DNA与“两对半” HBsAg() HBV-DNA() HBeAg () HBV-DNA() 4. 4. 也可能出现也可能出现HBsAgHBsAg( () )，HBV-DNA(HBV-DNA() )。 5. 5. HBsAbHBsAb ( () ) 、 HBcAbHBcAb ( () ) 、 HBeAbHBeAb ( () )三抗体阳性三抗体阳性 与与HBV DNA 2.5 HBV DNA 2.5 103 copy /ml /ml 结果解
7、释。结果解释。 HBV (三) HBV-DNA定量检测的临床意义 3. HBV-DNA定量与预后 a. 含量高者急性肝炎患者易慢性化 b. 癌变的几率明显高于含量低者 1. HBV-DNA定量与HBV复制水平及传染性 2. HBV-DNA定量与乙肝药物疗效 a. 专家提出103 copy /ml做为阴性或临床治愈标准 b. HBV-DNA定量分析与干扰素治疗(前、中、后) c. 拉咪呋啶 HBV感染与干扰素治疗 治疗前： a: 治疗前HBV低水平复制者对干扰素的反应性明 显优于高水平复制者。 b: 治疗前HBV DNA 含量特别高者大多没有疗效 。 c: HBsAg转阴的几乎都是那些治疗前血清
8、HBV DNA 含量较低者。 HBV感染与干扰素治疗 治疗中： a: a: 病毒复制水平迅速降低者，有望治愈。 b: b: 相反，治疗期间HBV DNA复制水平下降较慢， 或下降幅度较小，或者变化不明显者，大多是 干扰素治疗无效。 HBV感染与干扰素治疗 治疗后： a: 治疗结束后，采用PCR定量法检测，HBV DNA 103 copy/ml 者，可能不再复发。 b: 终止治疗后HBV DNA 仍保持较低水平者， 反跳的可能性较大。 ALT Months after Start of Therapy 0 Normal Alt 治疗前 1234561224 HBV DNA HBe Ag HBs
9、Ag Poor Response to IFN TherapyPoor Response to IFN Therapy CHRONIC HEPATITIS BCHRONIC HEPATITIS B 拉咪呋啶： 有显著降低高病毒载量作用，近期疗效 颇有优势，但是长期使用可导致HBV变 异，患者易出现耐受性，而且容易出现 停药后反弹。 HBV感染与拉咪呋啶治疗 0 -20 -40 -60 -80 -100 治疗周数 拉米夫定 安慰剂 血清HBV DNA; 中位%变化 0 4 8 12 16 20 24 28 32 36 40 44 48 52 n=192 n=404 n=171 n=359 拉米夫
10、定抑制血清拉米夫定抑制血清HBV DNAHBV DNA HBV (三) HBV-DNA定量检测的临床意义 4. HBV-DNA定量有助于指导怀孕与孕期，哺乳期检查 5. 肝脏移植与HBV-DNA Mazzaferro等报告：105copy /ml 发生了严重HBV再感染 6. 血液制品和献血员的筛选 病毒特点： 1. 单正链RNA病毒 2. E1和E2区基因高度变异性 （一）丙型肝炎病毒特点 HCV 感染特点： 1. HCV在血中含量极微 输血后肝炎主要致病因子 免疫学标志仅有抗-HCV，非中和抗体，产生时间不一 1. 有一部分人感染HCV后，不产生抗-HCV 2. 感染易于慢性化(50-85
11、%) 3. 疫苗研制尚不成功 单链RNA (二) HCV-RNA定量检测的临床意义 1. 早期诊断 a. 临床以 80 copy/ml做为无感染或治愈标准。 b. HCV感染1-3W，即可检出HCV-RNA的存在。 c. 严格筛选献血员 ,提高对窗口期感染者的检出率。 d. 医疗纠纷中的“举证倒置”，病人入院前后进行HCV- RNA检测。 HCV HCV (二) HCV-RNA定量检测的临床意义 2. HCV-RNA载量与抗-HCV滴度、ALT水平之间的相关性。 抗-HCV滴度和ALT异常率随着HCV-RNA载量升高而增加。 3. HCV-RNA是评价抗病毒治疗效果的重要指标。 4. 慢性丙型
12、肝炎长期抗-HCV阳性，这时如果进行HCV-RNA 定量检测可以鉴别活动性、复制程度。 二 常见性传播疾病病原体 一 淋球菌（NGH） 二 沙眼衣原体（ CT ） 三 解脲脲原体（UU） 四 梅毒螺旋体（TP） 五 单纯庖疹病毒（HSV） 六 乳头瘤病毒（HPV） 七 人类免疫缺陷病毒（HIV） 八 EV71 A16 通用型 STD 艾滋病 艾滋病是英文AIDS（Acquired Immunity Deficiency Syndrome) 的中文译音，全称是“获得性免疫缺陷综合 征”。它可以由人类免疫缺陷病毒（HIV,Human-being Immunity Deficiency Virus
13、），又称艾滋病病毒引起 的疾病。当病毒侵入人体后，经一段时间的潜伏期，破 坏人体的免疫力，从而发病，病死率高，是一种严重的 传染病。 艾滋病是一种有明确病原体的可通过人之间一定 传播途径传播的慢性传染病，属于传染病防 治法中规定的乙类传染病 HIV病毒：多亚型和多变异 HIV-1和HIV-2 M组、O组和N组 亚性型：A-K CRF：基因重组亚型，主要是HIV-1型 毒株亚型监测的意义 不同亚型与不同传播途径的关系：B主要通过男性同性 性行为和静脉注射吸毒传播，C主要异性性接触传播 流行地理和传播线路的分析：东南亚区域的C亚型和B 亚型 重组亚型传播效力变化及对流行的影响：东欧的B/A重 组流
14、行、泰国的A/E重组 艾滋病病毒在外界的抵抗力 HIV病毒一旦离开宿主细胞在外界环境中生存能力 很快消失 HIV对环境中的物理因素和化学因素抵抗力均较弱 ，比乙型肝炎病毒（HBV）的抵抗力低得多 对HBV有效得消毒和灭活方法均适用于HIV 典型进展者：8-10年潜伏期后成为艾滋病人， 80% -90% 快速进展者：CD4细胞2-5年内迅速下降，HIV病 毒载量一直维持较高水平，而且分离的HIV有均 一性。 长期存活者（又称长期不进展者）：维持15年以 上，而且CD4计数维持正常，在所有感染者中 比例一般在8%-10%。 HIV感染的三种结局 艾滋病的诊断 HIV感染者：确定HIV感染的个体 抗
15、体检测：初筛和确认 辅助诊断 艾滋病病人：临床诊断标准见国家标准HIV/AIDS 的诊断标准和防治原则 GB16000-1995 荧光定量PCR的应用为艾滋病的初筛和辅助 检查提供了有力的工具 NGH 淋球菌感染与致病 1. 人是淋球菌的惟一宿主。 2. 发病率最高，在所STD疾病中，高达60%左右。 3. 发病趋势： a. 男性多于女性。 b. 城市走向农村， c. 高收入阶层向低收入阶层扩展 4. 人对淋球菌感染无天然抵抗力，免疫不持 久，再感染和慢性患者普遍存在。 5. 如母亲为淋病患者，婴儿出生时易患上淋球菌性结膜炎 CT 沙眼衣原体感染与致病 1. 严格的细胞内寄生。 2. 不仅可致眼部感染、肺部感染、也是STD的主要 病原体。 3. 近年来在欧美等国，沙眼衣原体的感染率和危害 性已超过淋球菌而居STD之首。 4. 在我国，在非淋球菌性尿道炎中，居首位。 5. 泌尿生殖道感染，妨碍妊娠。 6. 盆腔感染，可致生殖能力损害。 UU 解脲脲原体感染与致病 1. 合成尿素酶，分解尿素 2. 在非淋球菌性尿道炎其感染率仅次于衣原 体感染，居第二位。 3. 流产超过4次以上者，检出率高达80%。 4. 有30-40%男性尿道炎是由感染UU所致。 5. 与男性不育相关。男
