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1、尿素的尿素的测测测测定定简简 介 尿素又称脲，是体内蛋白质分解代谢的含氮终产物，不与血浆蛋白结合，分子量仅为60，体内生成量受蛋白质摄入量，机体蛋白质分解代谢及肝脏（生成尿素的唯一器官）功能的影响。 尿素是表明游泳池水受到人体污染程度的一项重要指标。二乙酰一肟（diacetylmonoxime）法检测 尿素（urea）含量原理：尿素与二乙酰在酸性环境中加热可缩合成红色的二嗪衍生物，颜色深浅与尿素含量成正比。因二乙酰不稳定，故通常用二乙酰一肟代替，它与强酸作用，产生二乙酰。后者再与尿素反应，缩合生成红色的二嗪衍生物。 临床二乙酰一肟法 H+二乙酰一肟+水 二乙酰+羟胺 H+二乙酰+尿素 二嗪化合
2、物（粉红色）泳池二乙酰一肟法临临床二乙酰酰一肟肟法测测定尿素1 原理 尿素与二乙酰一肟在酸性条件下，经镉离子（或三价铁离子）的催化产生缩合，并在氨基硫脲存在下，生成了4，5-二甲基-2-氧咪唑化合物，颜色深浅与尿素含量成正比。2 试剂21 酸性试剂：在 1 L容量瓶中加入蒸馏水约 100 mL，然后加入浓硫酸 44 mL 及 85 %磷酸 66 mL，冷却至室温后加入硫氨脲 80 mg，硫酸镉 2 g，溶解后用蒸馏水稀释至 1 000 mL，贮棕色瓶中放冰箱内保存半年不变。22 2 %二乙酰一肟溶液：取 2 g 二乙酰肟，溶于蒸馏水中，定容 100 mL混合均匀，即可使用。尿素使用液：取酸性试
3、剂 90 mL加 2 %二乙酰一肟 10 mL，混合均匀即可。3 方法31 定性测定：取使用液 2 mL 加入试管中，加 0.1 mL牛奶，在电炉上快速加热至煮沸，保持沸腾 1 min，观察颜色，用不含尿素样品做比较。正常奶颜色为淡红色，添加尿素的牛奶反应颜色为玫红色。32 定量测定：取5mL使用液加入0.1mL牛奶，于20 mL的螺口试管中，加盖拧紧，于 95 水浴中反应 20 min，过滤后，于 525 nm处测定吸光值。4 结果 由于正常牛奶中含有少量的尿素，所以正常牛奶的反应试管也是有颜色的，由于尿素含量较少，所以颜色为淡红色。尿素含量异常的牛奶，反应后颜色为玫红色。两者的区别明显，在
4、实际的质量控制中，应以正常奶做比较，来判断原料奶中尿素含量的水平，进而做出判断。5 小结优点：灵敏度高，操作简单，适用于自动仪器分析。缺点：反应不专一，线性范围窄（150mmol/L),特异性低，试剂腐蚀性强，加热有异味释放。难以实现自动化。游泳池水中二乙游泳池水中二乙酰酰酰酰一一肟肟肟肟的的检测检测检测检测 方方法法 常采用卫生部颁发的二乙酰一肟分光光度法(简称原法) 。 二乙酰一肟分光光度法（国标法）1. 原理 尿素与二乙酰一肟及安替比林反应呈现黄色, 在波长460 nm 处有最大吸收峰,与标准系列比较定量。2 试剂21二乙酰一肟溶液(2 g/L) : 取02g二乙酰一肟CH3COC (N
5、OH) CH3 溶于10% 乙酸中,并稀释至100 ml,保存于棕色瓶中。22安替比林溶液(2 g/L) :取02g安替比林C6H5NN(CH3 )C(CH3 )CHCO溶于1 + 1硫酸中并稀释至100 ml,保存于棕色瓶中。23尿素标准储备溶液(100g/ml)和尿素标准使用溶液(10g/ml) 。24仪器和器材UV - 2102C型分光光度计、沸水浴锅、25 ml棕色具塞比色管(粗细、玻璃厚薄均匀一致) 。3 分析步骤31 吸取水样10ml（尿素含量在00010015mg范围内）于25ml棕色具塞试管中，另取棕色具塞试管加入尿素标准使用液0、01、03、05、07、09、11、13、15
6、ml，并用纯水稀释至25ml。（注：显色后溶液遇光退色，故需用标色法）。32 于上述各管加入10ml二乙酰肟溶液，混均。再加安替比林溶液20ml，混匀。33 将上述试管在沸水浴中加热50min。取出并在流动的自来水中冷却2min。立即以纯水为对照，在460nm处，用1cm比色皿，测定各管吸光值（加热4555min，呈最深色，若再延长时间吸光值下降）。34 以浓度对照吸光值，制备标准曲线。以水样吸光值从曲线上查出尿素含量。4 小结 优点：操作简便、灵敏度高。 缺点：线性范围窄、反应时间长、标准曲线相关系数难以达到0.1999以上，对于尿素浓度高的水样,虽可将水样稀释后进行测定,但稀释倍数难以估计
7、, 所以需反复重测 , 既费时,又浪费试剂。二乙二乙酰酰酰酰一一肟肟肟肟分光光度法（改分光光度法（改进进进进）1 原理 目前二乙酰一肟-安替比林分光光度计 1 是测定尿素的唯一标准方法, 该法存在标准曲线线性范围较窄( 011 11 5 m g /L), 吸光度偏低,反应产物不稳定, 溶液显色后遇光褪色等多种问题, 对检测结果影响较大, 为此本法参阅有关文献 2, 3 , 通过摸索, 将国标法中的标准曲线扩大, 定容体积由25 m l改为10 ml, 使线性范围变宽, 吸光度的值增大, 标准系列的稳定时间长, 结果满意, 其准确度、精密度较好, 能满足基层实验室的需要。2 试剂21 02二乙酰
8、一肟溶液：称取02g二乙酰一肟CH3COC：（NOH）CH3溶于10乙酸中，并稀释至100ml，保存于棕色瓶备用。22 02安替比林溶液：称取02g安替经林（1，5二甲基2苯3吡唑酮C6H5NN（CH3）C（CH3）：CHC：O），溶于11硫酸中并用混酸稀释至100ml，棕色瓶中保存。（注：硫酸浓度大于11时，显色缓慢且操作不便。）23 尿素标准溶液：准确称取01000g尿素于小烧杯中，加少量纯水溶解后转入1000ml容量瓶中，加01ml氯仿并用纯水定容，此液每ml含01mg尿素。冷藏保存。24 尿素标准使用溶液，准确吸取尿素标准储备溶液1000ml于100ml容量瓶中，用纯水定容，此液每ml
9、含001mg尿素。3 分析步骤31取游泳池水样10 ml于25 ml比色管中。另取尿素标准使用溶液( 10g/ml) 0、025、050、100、200、300、400、500、600 ml (尿素含量为0、25、5、10、20、30、40、50、60g) ,各管加纯水至10 ml,做标准系列。32样品及标准系列管各加入110 ml二乙酰一肟溶液,摇匀,再加入210 ml安替比林溶液,混匀后置沸水浴锅中煮沸20 min (建议同时放入同时取出,或按次序放入、取出,以保证加热时间的一致。在样品多时这点尤为重要) ,在沸水浴时轻轻盖上比色管塞,以防溶液蒸发。33停止加热后在冷水浴(1015,冷水浴
10、水位高于比色管中溶液为佳) 中冷却2 min, 再次混匀后以纯水为对照, 在460 nm处,用1 cm 比色皿,在避免阳光直射的条件下测定吸光度。绘制标准曲线并求得样品中尿素的浓度。4 小结 用改进后的二乙酰一肟比色定量法,标准曲线线性范围较原法有了很大提高,最高浓度可以测到610 mg/L,超过610 mg/L 的水样进行一倍稀释基本上均在标准曲线线性范围以内, 并保持原法的精密度与回收率; 煮沸时间由原来的50 min缩短至20 min,消除了由于长时间煮沸造成的各管溶液体积不一致、从而导致测定结果不准确的弊端;方法的精密度、准确度好,优于原法,且符合卫生检验的要求。国标标法改进进前后对对
11、照表加热时间优点缺点改进前50分钟灵敏度、重现性、回收率高费时、遇光易褪色、线性范围窄改进后20分钟精密度、准确度好省时、显色较稳定、线性范围宽二乙酰一肟-氨基硫脲（thiosemicarbazide）法 氨基硫脲 作用 酸性试剂中的氨基硫脲与硫酸镉可促进尿素与双乙酰结合，提高灵敏度和显色后的稳定性。化学式CH5N3S结构式H2NNHCIISNH2起主要作用2（NH2)2-C=O + 2（NH2)2-C=S-（NH2)2-C=C(NH2)2 + SO2 + S（尿素） （氨基硫脲）反应关系式1原理 尿素在氨基硫脲存在下，与二乙酰一肟在强酸环境中加热，生成红色的二嗪衍生物。显色强度在一定范围内与
12、尿素含量成正比。2 试剂21 酸性试剂 浓硫酸200ml与磷酸300ml混匀，冷至室温。加 氨基硫脲50mg，硫酸镉2.0g溶解，棕色瓶冷藏至少可保存一年。22 二乙酰一肟溶液 称取4.0g二乙酰一肟，溶解后加纯水至200ml，棕色瓶冷藏可保存半年。23 尿素标准贮存液 准确称取0.1000g尿素，加少量纯水溶解 后，移至1000ml容量瓶中，加5滴三氯甲烷作防腐剂，用纯水定容至刻度。4保存，此溶液尿素浓度为0.1mg/ml。24 尿素标准使用液 临用时将尿素标准贮存液稀释10倍。此溶液尿素浓度10ug/ml。3 操作步骤31取水样10ml于具塞标准比色管中。另取比色管8只，分别加入10ug/
13、ml的尿素标准使用液0、0.10、0.25、0.50、1.00、2.00、3.00、5.00ml，各加水至约10ml。32 每管各加酸性试剂5.0ml，2%的二乙酰一肟溶液2.0ml，加纯水至25ml。沸水浴12分钟，取出后用冷水冷却至室温。33 以空白管调零，在540nm处，用1cm比色皿测定各管吸光值。以浓度对照吸光值，制备标准曲线。以水样的吸光值在标准曲线上查出尿素含量。4 结果 本法操作简便，溶液显色稳定，线性范围宽，试剂稳定时间长，适合平时工作中使用。 作用 作显色稳定剂。化学式（CH3）2CHOH结构式H3C异丙醇CHCH3IOH二乙酰一肟-异丙醇-安替比林法1 原理 在原发的基础
14、上，选择异丙醇作显色稳定剂对游泳池水中尿素进行测定，使标准曲线的线性范围有了很大的提高，缩短了煮沸时间，方法的精密度、准确度优于原法，且符合卫生检验要求。2 试剂 2.1 二乙酰一肟-异丙醇溶液 称取1.0g二乙酰一肟溶于1+9乙酸溶液中，并使其总量为100ml，于此溶液中加入异丙醇50ml，混匀，棕色瓶中保存。2.2 安替比林溶液 称取0.2g安替比林溶于1+1硫酸中，并使其总量为100ml，棕色瓶中保存。2.3 尿素标准贮备液 称取0.1000g尿素，溶于少量水后移入1000ml容量瓶中，加0.1ml氯仿并用水定容，冷藏保存，此液1.00ml含0.100mg尿素。2.4 尿素标准使用液 吸
15、取尿素标准贮备液10.00ml于100ml容量瓶中，以水定容，此液1.00ml含10. 0ug尿素。2.5 实验用水均为去离子水。3 测定步骤3.1 吸取水样10.0ml于25ml无色具塞比色管中，另取同型比色管分别加入尿素标准使用液0、0.20、0.50、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00ml，以水定容至25ml。3.2 于上述各管中加入二乙酰一肟-异丙醇溶液1.50ml，混匀。再加入安替比林溶液2.00ml，混匀。3.3 各管加塞后同时置沸水浴中加热20min，取出，在流动的自来水中冷却2min。以水为对照，于460nm处，用1cm比色皿测定各管吸光度。3.4 计算标准系列直
16、线回归方程，以水样吸光度代入方程，求出水样尿素含量。 4 小结 与标准方法比较，有遇光不退色，可用普通无色比色管操作；线性范围扩大，一般游泳池水样可不经稀释一次完成测定；沸水浴时间大大缩短，节约时间等优点。应用于游泳池水中尿素的测定，其重现性、回收率、与标准方法的对照试验，均获得满意结果。临床与预防二乙酰一肟法的区别线性范围准确度、精密度味道反应时间临床窄低加热有异味长预防宽高无短3 讨论3.1 尝试以异丙醇、异丁醇、正戊醇、丙酮、乙腈、甲醇、乙醇、丙醇、正丁醇、甲醛、正辛醇、异戊醇等十余种有机溶剂作显色稳定剂试验，结果显示：甲醛使显色无法进行；正辛醇、异戊醇水溶性差，溶液出现混浊；其余试剂均
17、有显色稳定作用，但以异丙醇显色后最稳定，灵敏度较高，水溶性好，且为常用试剂，无毒，易购得，故选之。异丙醇的使用，弥补了标准方法3.2 经实验，异丙醇用量在0.40.6ml/管时，空白值较低，灵敏度较高，稳定性好，故选其中间值（0.5ml/管），按此比例将其与二乙酰一肟试剂混合后加入，操作方便，且不影响二乙酰一肟试剂的稳定性。3.3 当二乙酰一肟溶液用量为1ml/管，其浓度为10g/L与20g/L时，灵敏度较高，且两者基本相同，而当其浓度为2g/L时，灵敏度大大降低，故选其浓度为10g/L。因其与异丙醇混合后一次加入，为达二物质最佳显色量，故该混合试剂加入量为1.5ml。3.4 当安替比林溶液用
18、量为2ml/管，浓度为2g/L与10g/L时，对测定基本无影响，故保持标准方法中该试剂2g/L的浓度。3.5 实验表明，沸水浴时间从1540min，随加热时间的延长，吸光度增加，标准斜率加大，继续延长加热时间，则线性变差。加热25min时，50ug管吸光度近0.8，仪器测定误差加大，故本法选用沸水浴加热20min，比标准方法的沸水浴50min时间大大缩短。因沸水浴时间不同，吸光度差别较大，故水样应与标准系列同批测定。同时，沸水浴容量应较大，避免过挤致受热不匀，使反应不均匀、完全。3.6 作标准系列及水样显色定容后立即至26h稳定性试验，实验结果显示：在显色定容后2h内呈色稳定，测定偏差小，比色
19、测定最好在此期间完成。延长至20h间，吸光度值逐渐增大，但在此期间只要标准系列与水样为同批测定，对低、中浓度样品结果基本无影响，高浓度样品偏差稍大，但尚可接受（相对偏差5%）。若再延长时间则不可取。3.7 游泳场所卫生标准（GB9667-1996）中规定尿素应3.5mg/L。本法线性范围包容了上述浓度，对一般水样可直接一次测定完成，避免了标准方法测定尿素浓度在1.55mg/L水样时，因超出线性范围需将样品稀释后重新测定的麻烦及引入的误差。本法从十余种有机溶剂中筛选出异丙醇作显色稳定剂，并经反复实验研究，对游泳池水中尿素测定的标准方法作了改进。与标准方法比较，有遇光不退色，可用普通无色比色管操作
20、；线性范围扩大，一般游泳池水样可不经稀释一次完成测定；沸水浴时间大大缩短，节约时间等优点。应用于游泳池水中尿素的测定，其重现性、回收率、与标准方法的对照试验，均获得满意结果。自己的想法自己的想法化学性质： 红色粉末，微溶于水，溶于醇和稀酸。主要用于鉴定羰基化合物（-CO）。是易燃易爆品，需小心使用。显色作用： 在酸性介质中，羰基化合物与2，4-二硝基苯肼（的甲醇-盐酸溶液）反应，生成 2，4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈暗红色，可用于分光光度法 （445nm处测 吸光度）或目视比色法测定羰基化合物。关于2,4-二硝基苯肼做显色剂替代安替比林的说明反应方程式：C6H3(NO2)2NHNH2+CO(NH2)2 C6H3(NO2)2NHN=C(NH2)2 +H2O
