微生物生长与调节3

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1、*微生物的生长与调节3 1.2 细胞周期 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细胞周期 对于个体细胞行为，主要关心 染色体启动、复制和分离 新细胞壁材料的合成与插入 协调染色体复制和细胞分裂的信号 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细胞周期 细胞周期(Cell cycle)： 细胞的一系列可鉴别的周而复始的 生长活动。这些活动的顺序不变, 完 成一个活动后才能进行下一个活动 。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 图1 细胞周期 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细胞周期 典型的真核生物细胞周期如图所示: S, M 和G1, G2分别代表DNA 合成, 有丝分裂期 和两次间隙。 若生长速率因养分多寡而改变, S,

2、 G2 和M 几乎不变, 只有G1改变。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细胞周期 原核生物在低生长速率下的细胞周期, 与 真核生物相似。 其染色体复制期C 相当于 S； 细胞分裂期 D相当于G2+M； C 和D 不随生长速率变化, 只有G1可变动 。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 染色体复制与细胞分裂的调节 染色体复制怎样与细胞分裂协调？ 在高速生长下, 如细胞周期为30 min, 染色 体复制不能在一个周期内完成。 为此，未等前一轮复制结束，后一轮复制又 在原点上启动。 可以把C 期的启动和终止,以及细胞分裂看作 是不可更改的活动顺序, 称为C+D 周期。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 染色

3、体复制与细胞分裂的调节 若增代时间少于 C+D时间, C+D 周 期重叠，其重要特征是分配到子细 胞的染色体已开始新的一轮复制。 这类染色体称为二叉染色体 (dichotomous)。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 图2大肠杆菌的染色体复制和 细胞分裂的时间分配示意图 *微生物的生长与调节3郭晓燕 染色体复制和细胞分裂的调节 规律 染色体复制未完成， 细胞就不会分裂。 不管生长速率如何，大肠杆菌的细胞分 裂总是出现在染色体复制完成之后。 不管生长速率如何，C 和D 所需时间大 致不变。 C 和 D可以依次或同时(指上一轮的 D和 下一轮的C ) 进行。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 思考题 加

4、倍时间最小为多少？ 细胞周期的各项活动怎样去适应生 长速率变化的需要？ *微生物的生长与调节3郭晓燕 染色体复制的启动 染色体复制的启动受启动因子 (origin), 一种特异调节性蛋白的正 向控制。当启动因子增加到某一临 界水平, 启动便开始。在这以后启动 因子被毁或稀释。合成启动因子达 到有效浓度所需的时间恰好等于培 养物增代时间。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 染色体复制的启动 大肠杆菌在启动时的启动因子数量与细 胞质量之比在各种生长速率下是一样的 。这一比例实际上是染色体启动因子的 浓度。细胞似乎能检出启动因子的浓度 。当它达到一临界值时便启动新一轮的 复制。启动的直接后果是启动因子的

5、浓 度提高一倍。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 染色体复制的启动 启动不会重新发生直到其浓度因生 长而降到临界值。这种控制机制构 成一种生物钟。它是以细胞体积或 其它有关参数为依据。据此，染色 体复制的启动频率是DNA 合成速率 的控制步骤。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 启动和复制是性质截然不同的 两种过程 启动的过程需要蛋白质合成，如蛋白质合成受阻 ，已启动的DNA合成能完成，但不能启动新一轮 DNA合成 。 曾检出其产物负责启动而不负责随后复制的基因 ； 加入利福平或氯霉素抑制RNA或蛋白质合成或除 去营养缺陷型所需的氨基酸都能阻止启动，但允 许复制继续完成； 培养物进入稳定生长期后，中

6、止生长的细胞含有 完整的染色体。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 染色体复制的启动 启动总是在染色体上的专一位置上进行 。此位点称为复制或染色体原点。在大 肠杆菌此位点很靠近ilv座位。 在大肠杆菌和枯草杆菌中复制叉以两个 方向沿染色体运行，大约在离原点180度 地方相遇。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 染色体复制的启动 启动的频率取决于细胞量增长的速 率，即生长停止，启动也随着停止 是预料中的事。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细胞周期的研究方法 1 镜检法 用电子显微镜观察单个细胞的生长，定 时拍照。由此发现大肠杆菌在分裂时细 胞个子的变化不大。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细胞周期的研究

7、方法 1 镜检法 说明似乎存在一种控制细胞个子大 小的因子，即尺寸因子(size factor), 可能是启动细胞质量 (initiation mass)。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 1 镜检法 缺点:细胞由培养液转移到固体 表面,会受到干扰。 细胞年龄变化较大时,细胞大小 变化不大。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 2 同步培养(Synchrony)法 (1) 密度梯度离心沉降法 按细胞的大小/年龄把在对数生长期的培养 物分级。 H2O/D2O密度梯度沉降法: 能应用于任何品种, 不会施加渗透压强 的影响。 从某一密度带便可分离出同质的细胞群体 ，随后培养。 *微生物的生长与调节3郭晓燕

8、细胞大小的分布频率与蛋白质 合成速率的关系 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细胞大小的分布频率与蛋白质 合成速率的关系 蛋白质合成速率与细胞长度(体 积)成正比，从而与细胞年龄成 正比。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 (2)过滤洗脱法 将细胞粘附在固体支持物，如硝化 纤维膜上，然后将其倒置，让生长 培养基从上到下通过，新生的细胞 便被洗脱到培养基中，呈一种特征 性的振荡模式，见图123。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 过滤洗脱法 *微生物的生长与调节3郭晓燕 (2)过滤洗脱法 在初始冲洗(wash-off)期后从滤膜上 洗脱下来的主要是新分裂的细胞。 在洗脱曲线高峰下从膜上洗下的细 胞是沉积在膜

9、上的新生细胞后代， 那些在低峰下的是其沉积时正要分 裂细胞后代。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 过滤洗脱法 洗脱(wash- off)的振荡模式可以 测出细胞周期。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 3 同位素示踪法 如亲本培养物沉积在滤膜上之前用 氚标记的胸苷使细胞带上标记，则 结合到洗脱细胞的标记量与结合到 亲本培养物那一年龄细胞的标记量 成正比。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细胞周期 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细胞周期 其一个洗脱峰(后代)带有比前一代少 一倍的放射性标记。 可以分别求得C和D值 *微生物的生长与调节3郭晓燕 3 同位素示踪法 另一种研究细胞周期的方法是通过 蔗糖密度梯

10、度离心，使一对数生长 的培养物沉淀, 收集最上层的细胞， 在含有氚-标记胸苷的生长培养基上 生长，测量其DNA合成速率。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 3 同位素示踪法 洗脱前在无标记培养基中生长，洗 脱时用带标记的培养基，得到的带 标记DNA呈阶梯上升状。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细胞周期 *微生物的生长与调节3郭晓燕 1.2.4 生长速率与细胞个子大 小的关系 生长培养基越丰富，细菌生长速率 加快，其细胞的个子也越大。 如在同一种培养基内改变温度也会 影响生长速率，但对细胞个子大小 几乎没有多大影响。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 4 生长速率与细胞个子大小的 关系 如一细胞的增代时

11、间为60min，在细 胞分裂时染色体复制便开始启动。 假设细胞这时具有质量为M (启动细 胞量=1/启动因子浓度)。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 4 生长速率与细胞个子大小的 关系 个体细胞的量在指数地增加，直到 2M，细胞便开始分裂。 此时从培养液中检出新生的细胞， 置于较丰富的培养基 (能使菌快速生 长, 增代时间为35 min) 中，并假定 细胞迅速调整到新的生长速率。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 4 生长速率与细胞个子大小的 关系 这样，个体细胞量增长速率往上移 动，如C+D规律还适用，下一个细 胞分裂的时间不会变动，但细胞个 子会增大。 新一轮复制的启动将在细胞分裂前 便开始。

12、*微生物的生长与调节3郭晓燕 4 生长速率与细胞个子大小的 关系 换句话说，C+D 周期现在开始重叠 。快速生长经一个细胞周期后便达 到新的平衡。生长速率越快，细胞 个子的差异也越大。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 生长速率对细胞个子和染色体 复制启动时间的影响 *微生物的生长与调节3郭晓燕 生长速率对细胞个子和染色体 复制启动时间的影响 可用式1-27 表示细胞周期t对指数培 养物的细胞个子平均大小M 的影响 。 M = K2(C+D/t) (1-27) 曲线的形状将取决于C，D 和K 是否 变，只有在简单情况下logM与t作曲 线才会得一直线。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细菌培养物的生

13、长周期 在一来自静止期细胞的培养物的生 长期间，在细胞数目开始增加以前 有一相当长的停滞期。细胞量开始 增长的滞后现象短一些。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细菌培养物的生长周期 如达到物态的指数生长，则所有可测的 参数也将平行地增长。 当培养物进入静止期便发生与上述相反 的活动顺序。 因启动速率比细胞分裂早减速CD分钟 。 细胞量增长下降时，细胞分裂继续指数 进行，细胞渐渐变小。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细菌培养物的生长周期 *微生物的生长与调节3郭晓燕 细菌培养物的生长周期 新的一轮DNA复制的启动频率 取决于新细胞量的积累速率，则 吸光度与细胞数目至少有CD 分钟不平行。 *微生物

14、的生长与调节3郭晓燕 生长速率和DNA浓度 细胞中的DNA%随生长速率的增加而下降 ，可用式1-28表示: G/M=/(KC ln2)(1-2-C/) (1-28) 式中G 是基因组的当量，为每个细胞的 DNA 平均值。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响 展示了3种质量倍增时间： a) 70 min， b) 40 min， c) 20 min *微生物的生长与调节3郭晓燕 生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响 一个启动细胞量单位含有一个刚开始一 轮复制的染色体。用一水平线C 分钟长 度表示。它在纵轴上所处高度代表细胞 量。假定细胞量的复制时间为70

15、 min， 见图1-28a，将出现轮与轮复制的间隙。 当细胞量增加到三倍时它将完成4 个复 制好的染色体。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响 如在零小时把细胞置于增代时间为40 min的培养基内，见图1-28b，则新一轮 复制将紧跟在上一轮复制完成之后开始 ，轮与轮之间不存在间隙。待细胞量增 到3个单位时，第二轮的复制将不会完成 。结果得到2条复制了一半的染色体， DNA浓度下降到3/3。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响 如将细胞置于增代时间为20 min的培养 基内, 在第一轮复制还未完成前第二轮复 制已开始。

16、当细胞量达到3 时, 只有一个 带三个复制叉的染色体，见图1-28c， DNA 浓度进一步下降到2.25/3。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 生长速率对DNA浓度和平均染色体构型的影响 *微生物的生长与调节3郭晓燕 生长速率影响染色体上不同位 置的相对基因拷贝数 在一随机的指数培养物中，接近原点处 的基因，其拷贝数总是居多，靠近两端 的较少。 这种相对基因剂量的倾斜度随生长速 率的增加而提高。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 生长速率影响染色体上不同位 置的相对基因拷贝数 DNA的浓度随生长速率的增加而下 跌，从而不同程度地影响基因浓度 。那些靠近染色体原点的基因浓度 没有变化；位于中间的基因平均浓 度则只有原点周围的一半左右；处 在染色体复制近末端的基因浓度最 低。 *微生物的生长与调节3郭晓燕 生长速率影响染色体上不同位 置的相对基因拷贝数 在一个细胞周期内，一个基因浓度 相对另一个而言，可相差4倍。生长 速率对不同作用，提供了一种解释 非随机基因次序的理由。 *微生物的生长与调