微生物药物学第六章 抗菌肽解析

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1、第六章 抗菌肽 - 抗菌药物新资源 第一节 抗菌肽类活性物质的发展 一、抗菌肽简介 从微生物代谢产物中分离得到的一些多肽类抗生 素很早已经被应用; 但继1980年在美国天蚕体内发现了第一个动物来 源的抗生素多肽杀菌肽（cecropin）以来，在 昆虫、两栖类、水产动物、包括人在内的哺乳动 物甚至植物及细菌等广泛的生物谱中发现了至少 1700余种抗菌肽; 它们构成了宿主抵抗外来病原菌感染的第一道防 线。 一、抗菌肽简介 抗菌肽是一类带正电荷的两亲性小分子肽 的总称，通常含有1150个氨基酸残基。 按抗菌肽来源分为: 微生物抗菌肽; 动物抗菌肽; 人源性抗菌肽; 植物抗菌肽等。 一、抗菌肽简介 其

2、中动物抗菌肽又分为: 昆虫抗菌肽; 哺乳动物抗菌肽; 两栖动物抗菌肽3大类。 根据抗菌肽作用对象的不同，又可以分为: 抗细菌肽; 抗真菌肽; 抗肿瘤肽；既抗细菌又抗真菌的抗菌肽; 既抗肿瘤又抗微生物的抗菌肽等类型 。 一、抗菌肽简介 如此繁多的抗菌肽有其共同的特性，即微量抗菌 谱广（包括革兰阳性菌、革兰阴性菌、真菌、寄 生虫），同时有抗某些带包膜病毒的作用，甚至 可杀伤肿瘤细胞，但且大多数抗菌肽对正常真核 细胞无毒性或低毒性，且几乎无耐药性。 正因如此，抗菌肽亦被称为“天然的抗生素“，因 其有望克服日益严重的抗生素耐药问题而引起了 人们极大的兴趣。 一、抗菌肽简介 对动物来源的抗菌肽的研究发现

3、它们中的大多数是生物 预防微生物感染的天然防卫系统的重要组成; 在人和其它哺乳类中，这些多肽如防御素（defensins） 是中性白细胞构成中的主要蛋白类物质（总共为10 18%），中性白细胞是对微生物侵袭和急性感染起着直 接防卫作用的最重要的细胞; 其它细胞也能产生这些多肽; 在受伤的黏膜表面包括舌、气管、肠等发现有高浓度的 多肽，这可能是一种重要的黏膜保护成分。 一、抗菌肽简介 当科学家研究受伤的青蛙和蟾蜍为什么在 恶劣的环境下不受感染的原因时，发现了 滑瓜蟾素（magainins）; 滑瓜蟾素和昆虫多肽如杀菌肽都由受伤后 诱导产生，可以假定，这种诱导反应与生 物体产生的免疫反应相似。 二

4、、阳离子多肽的基本结构和功能 阳离子多肽有两个显著的特征： 一是根据组成多肽分子的精氨酸和赖氨酸的数量，这些多肽 具有至少一个净的二价正电荷，这些氨基酸在自然pH条件 下都带有正电荷； 二是这些带有正电荷的多肽能够在与细菌质膜发生作用时折 叠成三维空间结构，从而可以形成由一个非极性氨基酸侧链 组成的疏水面，和另外一个由极性氨基酸残基和带有正电荷 氨基酸残基组成的亲水面; 尽管这些阳离子多肽都具有这两个面，但其在氨基酸组成、 多少和与细胞质膜发生作用后所形成的三维结构上差距甚大 。 二、阳离子多肽的基本结构和功能 根据已经发现的100多种阳离子多肽在细菌质膜上形成的三维结 构可以将其分为4种类别

5、： 第一种为-螺旋结构：如cecropins（从昆虫Hyalophora cecropia 中分 离得到）和magainins(从非洲蛙Xenopus laevis中分离得到)； 第二种为由2至3个二硫键桥稳定的-片层结构：如defensins（可来自 于不同的动物和植物）、protegrins（来自于猪）和tachyplesins（来 自于蟹）等； 第三种为含有一个或多个二硫键而形成环状结构的多肽：如bactenecin （来自于牛）； 第四种为富含某种特殊氨基酸如脯氨酸/精氨酸的伸展螺旋：如牛多肽 Bc5和Bac7，以及猪多肽PR-39等。 （a）：-片层结构的人 源defensin-1；

6、 （b）：-螺旋结构的 cecropin-melitlin杂合体； （c）：伸展螺旋的 indolicidin； （d）：环状结构的 bactenecin 三、阳离子多肽的作用机制 目前，国内外学者一致认为细胞膜是抗菌肽的主 要作用靶点，多肽通过肽膜脂作用而在细胞膜上 形成孔道: v造成细胞膜结构破坏; v膜内外电压失衡; v内容物泄漏; v最终导致细胞死亡。 带有正电荷的多肽（1）与带有负电荷的磷脂双层外表面（细胞质膜2） 结合，导致局部的磷脂双层变窄。在膜电位的影响下，多肽插入膜内形 成通道（3），导致胞质内分子外流，最终导致细胞死亡。 阳离子多肽穿过革兰阴性菌细胞外膜的自身促进吸收作用

7、带有正电荷的多肽与结合在脂多糖上的二价阳离子产生交互作用，导致增强 穿越细胞外膜的阳离子多肽的自身吸收。阳离子多肽在细胞外膜上产生的交 互作用也能导致增加其它常用抗菌药物的吸收，因而具有抗菌增强剂的作用 。阳离子多肽与细胞外膜上脂多糖的结合可以用来解释这些多肽具有抗内毒 素作用的原因。 三、阳离子多肽的作用机制 肽膜脂作用的具体机制，观点不一，较 为经典的有如下几种模式： v桶状孔道模式（barrel stave model）; v毯式模式（carpet model）; v虫蚀样孔道模式（toroidal (wormhole) pore model）。 桶状孔道模式和毯式模式 4、选择性杀伤机

8、制 抗菌肽的选择性杀伤机制一直是人们感 兴趣的热点之一，有人认为原核生物和真 核生物细胞膜的脂质特异性可以解释这一 点。 原核生物和真核生物细胞膜最主要的区别在于其脂质的组成和排列：哺乳 动物细胞膜外层脂质为其所特有的呈电中性的两性磷脂，主要是卵磷脂和 鞘磷脂；而细菌细胞膜则含有大量的带有负电荷的磷脂（如磷脂酰甘油和 心磷脂），且有时其含量会超过50，使其必然暴露于细胞外膜；此外， 革兰阴性菌细胞壁主要由带大量负电荷的脂多糖组成。 4、选择性杀伤机制 抗菌肽可以选择性的结合并渗透带有负电荷的细胞膜， 其动力在于两个方面： 膜与抗菌肽疏水端的疏水作用； 膜脂质所带的负电荷与抗菌肽所带的正电荷间的

9、静电吸 引作用。然而，起自身防御作用的抗菌肽的疏水性通常太 弱以至不足以与两性磷脂有效结合，从而防止了自身毒性 。 原核生物和真核生物细胞膜另一重要的区别在于后者含 有丰富的真核细胞特有的固醇类物质，Matsuzaki等研究表 明胆固醇的存在可以使人红细胞免受滑瓜蟾素的破坏。肿 瘤细胞等病变细胞膜脂质成分或排列变化可能是导致抗菌 肽对其杀伤的关键。 4、选择性杀伤机制 总之，细胞膜的理化性质决定了抗菌肽可以选 择性的广谱杀菌而且可以防止耐药的产生。首先， 酶解和向细胞外排药物等耐药机制不存在于抗菌肽 的抗菌过程； 另外，抗菌肽的靶分子（阴离子脂质）是广泛存在 于微生物界的重要的保守的细胞膜成份

10、，所以，耐 药的产生尤其困难甚至几乎不可能； 也就是说，原核细胞和真核细胞膜间最简单的电荷 区别是抗菌肽选择性杀伤、抗菌谱广且对正常真核 细胞几乎无毒性或低毒性的关键所在。 四、阳离子多肽的应用 v抗菌肽的发现不仅会推动临床抗菌药物的应用和 对控制各种难以治疗病原菌的感染起到重要的作 用，同时应用转基因技术将编码抗菌肽的这些基 因转入到植物或动物中，能够起到防止病原菌感 染的作用。 v抗菌肽因其独特的抗菌机制在工业、农业、畜牧 业及医药等方面具有广阔的应用前景。 研究开发发的公司名称多肽肽适应应症 Magainin PharmaceuticalsMSI-78(-螺旋) MSI-78 脓脓疱病

11、糖尿病足溃疡溃疡表面感染 Applied Microbiology/Astra/MerckNisin(lantibiotic)胃幽门门杆菌感染/溃疡溃疡 Applied Microbiology/Nippon ShojiNisin突变变体万古霉素耐药肠药肠球菌 Micrologix BiotechMBI-CN MBI-20系列（-螺旋） 革兰兰阳性菌感染 革兰兰阴性菌感染、普通抗菌 药药物的增效剂剂 IntrabioticsIB367(-片层层)口腔黏膜炎（口腔溃疡溃疡） XomaMycoprex(BPI衍生物)系统统性念珠菌病、 fluconazole 增效剂剂 目前正在进行临床研究的一些阳

12、离子多肽的适应症 第二节 防御素抗菌肽家族的研究进展 一、防御素的结构特征 哺乳动物的抗菌肽主要有两大类： 防御素和cathelicidins。 防御素为一族脊椎动物来源的抗菌肽，其富含-片 层结构及有一个由六个二硫键连接的半胱氨酸构架 ，进一步可分为-和-两个亚族； 在这两种防御素都含有一个三重交链的-片层结构 ，其中带有一个明显的“防御素折叠”。 Mitta 等从2种贻贝（Mytilus edulis 、Mytilus galloprovincialis） 中分离到多种抗菌肽，根据抗 菌肽的一级结构和半胱氨酸的不同分为4种： v防御素(defensins)； v贻贝素（mytilins）；

13、 v贻贝肽（myticins）； v贻贝霉素（mytimycins）； v目前对贻贝素研究的比较透彻。 二、防御素的分布 早在20世纪60年代，当人们研究豚鼠白细胞的抗菌活性时 ，就对多肽产生了兴趣，因为在白细胞中富含这种物质且 具有广谱抗菌的活性； 当人们在人白细胞中发现抗菌肽后，发现这种物质的分布 很广泛，其由上皮细胞产生并对宿主具有防御作用。在已 经研究过的哺乳动物以及小鸡和火鸡中，都发现有典型的 防御素多肽。从蛇毒也已分离到防御素类多肽（生长捕集 多肽，growth arresting peptide和响尾蛇胺， crotamines），其可能作为一种上皮宿主防御多肽，以 抵御更大的捕

14、食者。 三、微生物对防御素的耐受性 v 通过插入诱变的方法，已经鉴定了一些细 菌对防御素产生耐受性的特异性机制。破坏 phoP-phoQ双组分转录调节子，能够增加沙门 菌对防御素和其他阳离子多肽的敏感性。 四、防御素的其他生物活性 防御素还具有许多其他生理活性，如对单核细胞 、T-淋巴细胞和树突细胞的趋化活性（ chemotactic activity）； 人源的-防御素1和2，具有吸引记忆T-细胞和未 成熟树突细胞，这种化学吸引剂的作用可能是由 于防御素与细胞因子受体CCR6结合的缘故。尽 管这一生理学意义还没有被了解，但在发炎的皮 肤中高浓度的HBD-2（人源-防御素2）使防御素 有可能与

15、天然的细胞因子配体竞争。 四、防御素的其他生物活性 某些被称之为皮质激素抑制剂（corticostatins）的防御 素，通过与促肾脏腺皮质激素受体（ adrenocorticotropic hormone，ACTH）的非活化结合 ，达到相反的效果； 尽管这种活性将抑制免疫抑制性激素可的松的产生，但 对感染是有用的。另有报道称某些防御素在纳摩尔浓度 下，对哺乳细胞具有活化硝苯吡啶敏感的钙通道。也有 报道称某些与防御素遗传和结构相似的多肽，已经在雄 性生殖道，特别是副睾中发现。 第三节 Cathelicidins抗菌肽家族 一、Cathelicidins基因组成和生物合成 20世纪90年代，在进

16、行bactenecin5 cDNA的克 隆时发现cathelicidins抗菌肽具有共同的结构特 征，即N末端都含有一个cathelin区域（一个来 自猪白细胞的大小约12 kDa的蛋白），所以在 1995年将其命名为cathelicidins家族。研究证明 cathelicidins基因有4个外显子和3个内含子 。 二、Cathelicidins抗菌肽家族的结构特征 根据不同cathelicidins抗菌肽氨基酸的组 成和在特定环境中的空间结构特征，可将 其分为4类，即-螺旋、伸展螺旋、-片层 和环状结构抗菌肽。 （一）螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌活性 螺旋cathelicidins抗菌肽的抗菌谱广，既抗革 兰阳性菌，又抗革兰阴性菌，还抗许多耐药菌， 如耐甲氧西林金黄色葡萄球菌、耐万古霉素肠球 菌、多重耐药菌铜绿假单胞菌、大肠埃希菌包膜 和非包膜菌