《腺病毒介导grim19诱导人胶质瘤细胞分化及相关机制的实验研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《腺病毒介导grim19诱导人胶质瘤细胞分化及相关机制的实验研究（93页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、重庆医科大学 博士学位论文 腺病毒介导GRIM19诱导人胶质瘤细胞分化及相关机制的实验研 究 姓名：姚声涛 申请学位级别：博士 专业：神经外科学 指导教师：唐文渊 20090501 重庆医科大学博士研究生学位论文 腺病毒介导G R I M l 9 诱导人胶质瘤细胞分化及相关机 制的实验研究 摘要 背景与目的 胶质瘤是颅内最常见的原发性肿瘤。尽管近年来在手术、放疗、 化疗等方面已取得很大进展，但其疗效仍不容乐观。目前胶质瘤的诊 断、治疗取得了一定进展，根本上未改变这一致命肿瘤的自然转归， 因而探索新的治疗方法显得十分迫切和必要。随着分子生物学、免疫 学、细胞生物学的快速发展，生物治疗新的治疗方法
2、包括基因治疗、 诱导分化治疗为恶性胶质瘤治疗带来了希望。 信号转导调控的失控常会导致肿瘤的发生。其中作为转录因子的 信号转导和转录激活因子3 ( s i g n a lt r a n s d u c e r s a n da c t i v a t o r so f t r a n s c r i p t i o n3 , S T A T 3 ) 的异常表达与活化p S T A T 3 常常见于各种胶质 瘤。异常活化的S T A T 3 分子对维持胶质瘤的恶性进展是必要的，可以 促进许多抗凋亡与促肿瘤细胞增殖基因的非正常转录，从而使正常细 胞发生恶性转化。G R I M l 9 ( t h e
3、g e n e s a s s o c i a t e dw i t hr e t i n o i d - i n t e r f e r o n i n d u c e dm o r t a l i t y1 9 ) 是一种由维甲酸( r e t i n o i ca c i d ，R A ) 与干扰素1 3 ( i n t e r f e r o n1 3 ，I F N 一1 3 ) 联合诱导的一种细胞死亡调控基因，其在许多 肿瘤中具有促凋亡功能。近来发现G R I M l 9 作为一种肿瘤抑制分子， 可抑制由S T A T 3 组成性活化诱导的细胞转化；并在胶质瘤诱导分化的 重庆医科大学
4、博士研究生学位论文 过程中显著上调。在本研究中，我们构建、包装与纯化了携带人 G R I M l 9 基因的重组复制缺陷型的腺病毒，观察其介导人G R I M l 9 基 因在人恶性胶质瘤C H G 5 细胞的表达对细胞表形的影响；并从细胞增 殖、克隆形成、细胞粘附、侵袭及凋亡等方面研究G R I M l 9 基因是否 具有诱导C H G 一5 细胞的分化作用，同时探索分析其作用机制，为将来 胶质瘤的治疗奠定基础。 方法 1 选择A d E a s y 一1S y s t e m 腺病毒载体系统，利用亚克隆的方法将 G R I M l 9 基因片段从p C D N A 3 1 ( + ) G
5、R I M l 9 质粒克隆入穿梭质粒 p A d T r a c k C M V 腺病毒载体。重组成功的p A d T r a c k C M V - G R I M l9 载 体转化已预先转化的p A d E a s y 1 腺病毒骨架质粒的B J 5 18 3 菌进行同 源重组，构建重组腺病毒质粒p A d G R I M l 9 。 2 重组腺病毒质粒p A d G R I M l 9 转染人胚肾2 9 3 T 细胞，小量包装 出重组腺病毒A d G R I M l 9 ，经P C R 初步鉴定后反复感染2 9 3 T 细胞进 行大量扩增，并采用氯化铯梯度离心法纯化浓缩病毒。病毒滴度采
6、用 T C I D 5 0 法测定，应用E G F P 报告基因及有限稀释法检测对C H G 5 靶 细胞的感染效率。W e s t e mB l o t 法检测重组腺病毒A d G R I M l 9 中的目 的基因G R I M l 9 的表达。同样方式包装与纯化A d E G F P 对照病毒。 3 C H G 5 细胞分别经A d G R I M l9a n dA d G F P 感染的M O I 值感 染后分别在2 4 h , 4 8 h 以及7 2 h 观察细胞表形的变化。台盼蓝染色检测 细胞活力。C C K 一8 比色及软琼脂克隆形成实验检测细胞体外增殖能力 的变化。T r a
7、n s w e l l 小室及细胞粘附实验检测细胞外基质粘附及侵袭能 4 重庆医科大学博士研究生学位论文 力的改变T U N E L 实验及H o c h e s t3 3 3 4 2 染色法侦测G R I M l 9 表达对 凋亡影响。 3 免疫荧光染色检测p S T A T 3 ，G F A P 及V i m e n t i n 蛋白在C H G 5 细胞中的表达状况。 R e a l T i m eP C R 分别检测B c l 。2 ，B a x ，P C N A ， C m y c ，C C N D l ，G F A P o rS T A T 3 基因的m R N A 变化。2 -
8、- A A C T 法分 析各个基因的相对表达量。W e s t e r nb l o t 法进一步分析各基因蛋白水平 的变化。D H E 荧光探针染色分析活性氧R O S 的变化。细胞免疫组 化定性检测C D l 3 3 的表达。 结果 1 酶切及测序鉴定表明重组穿梭质粒p A d T r a c k C M V - G R I M l9 克隆成功构建。同源重组后的腺病毒质粒p A d G R I M l 9 经P a cI 酶切 后可见一条4 5 k b 和一条约3 0 k b 的条带，表明同源重组成功。P a c I 线 性化重组腺病毒质粒转染2 9 3 T 细胞进行包装，扩增的病毒上清
9、经P C R 鉴定表明扩增条带为G R I M l 9 ，证明包装成功。所将大量扩增的病毒 经过纯化与浓缩后A d G F P 与A d G R I M l 9 病毒的各自滴度可分别达 1 1 2 x 1 0 1 0 p f u m L ；与9 6 x 1 0 9 p f u m L 。纯化的病毒能有效感染C H G 5 靶细胞，A d G F P 与A d G R I M l 9 病毒对C H G 5 细胞感染的M O I 值分 别为1 0 与1 2 。W e s t e r nB l o t 结果重组腺病毒A d G R I M l 9 能显著提高 G R I M l 9 在C H G -
10、 5 细胞中的表达。 2 A d G R I M l 9 病毒感染导致C H G 5 的细胞形态显著改变。与 A d G F P 对照组比，A d G R I M l 9 显著抑制C H G 5 细胞的体外增殖，抑 制克隆形成能力( P 0 0 5 ；- k ：与C H G 5 组相比，P O 0 5 C o m p a r e dw i t hC H G - 5g r o u p ，P O 0 5 - k - k：与C H G 5 组相比，P 0 0 5 “ k C o m p a r e dw i t hC H G 一5g r o u p ， P o0 5 + ：与C H G 5 蛆夏A
11、d G F P 组相比均P 0 0 5 ) 。A d - G R I M l 9 感染组侵袭细胞细胞形 态出现变化，未完全恢复感染前的细胞外形且侵袭细胞的相对数目明显低于末 感染细胞组与A d - G F P 对照组( P 00 5 ；：与C H G 一5 组相比，P 0 们： F i g2 - 1 I T h e i n f l u e n c e o f A d - G R I M 9 v i e s i n f e c l i o no n i n v a s i o no f C H G - 5c e l l s e o m p a n t d w i t h C H G - 5 c
12、o n t r o lg m u p ，P ) 00 5 p a m d w i t h C H G - 5g m “ P ( 0 0 l 2 6A d G R l M 9 腺病毒感染对C H G 一5 细胞体外基质黏刚的影响( 平板 黏附实验) 如图2 一1 2 所示，C H G - 5 与A d - G F P 组A 值两两相比，无显著差异( P 0 0 5 ) 。 提示A d - G F P 病毒对C H G - 5 细胞的黏附能力无明显影响。A d G R I M l 9 组和C H G 5 组相比t 其A 值显著减少( P 0 0 1 ) ，提示G R I M l 9 能减弱C H
13、G 5 细胞的黏酣能力： 在前述A d G R I M l 9 导致C H G - 5 细胞聚集、脱壁、逐渐飘浮的细胞形态学改变与 粘附能力的减弱相关。 0 j芎盖ikojc 重庆E 科大学博研兜生学位论文 薯 囤2 1 2A d _ 6 R I M 9 病毒蒋鞋对C H G - 5 细胞粘附能力的影响 F i 9 2 - 1 2 T h e i n f l u e n c eo f A d G R I M 9v i r u s i n f e c t i o no 日a d h 幅i v ea b i l k Vo f C H G - 5 册s 2 7A d G R I M 9 腺病毒感染对
14、C H G 5 细胞R O S 活性氧产生的影响 A d 0 R J M 9 与A d E G F P 病毒按上述方法感染C H G 5 细胞7 2 h 后，采用R O S 红色荧光探针孵育，同一曝光条件下比较两组细胞红色荧光强度。因A d G F P 感 染组C H G 5 为单层细胞，而A d G R I M l 9 感染组细胞聚集成球形团状体，无法比 较两者的F 均荧光强度。 光镜荧光DHE染色 A d - G F P 感染组 o n l _ ，o n ，0 嚣陕g 辩大学博研兜生学位论立 光镜荧光DHE染色 A d G R I M l 9 意昶蛆 田2 - 1 3A d - G R I
15、 M 9 藕毒患染对C H G - 5 蛔胞R O S 产生的影响 F i 9 2 - 1 - ) T h e i n f l u e n c e o f A d - G R I M 9v i r u s i n f e c t i o no a R O S o f C H G 一5c e l l s 2 8 A d - G R I M 9 情毒感染对C H G 5 细B c l 2 ，B a x ，P C N A ，C C N D ! ， S T A T 3 ，C - m y c ，G F A Pm R N A 寰达的影响 T R I p u r e 法提取上述经病毒感染C H G 一5 细
16、胞总R N A 。以1 8 - a c t i n 基因作为内 参，每份标本均行3 复孔在A B I7 5 0 0 进行定量P C R 的检测与分析。反应条件为 9 4 C 3 0 s ，6 5 C 3 0 s7 2 “ C 4 5 s 收集荧光信号，6 4 行熔解曲线分析。采用相对定 量2 - A A C t 法比较各基因的表达差异：A C t 值= 目的基因c t 值内参基因Q 值： A A C ! 值= 目的组A C t 值对照组A C t 值A A C T - ( C T 目的基因- C T l 3 - a e t i n ) 实验组- ( C T 目的基因C T 3 - a c t i n ) 对照组) 1 。 重庆科太学博目究生学位论文 05 B C L 2B A XF C N AC C N D IS T A T 3 C - m y
