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1、1第一章基因组是地球上每一物种具有的生物学信息的存储库。指生物的整套染色体所含有的全部 DNA 或 RNA序列。转录组，即那些含有细胞在特定时间所需生物信息、编码蛋白质的基因衍生而来的 RNA 分子的集合。蛋白质组，即细胞中那些决定细胞能够进行生化反应的所有蛋白质组分2.理解基因由 DNA（或 RNA）组成的三个实验；肺炎双球菌的转化试验； 噬菌体感染实验； 烟草花叶病毒的感染实验。3.掌握双螺旋结构的关键特征： 1).DNA 分子通常以右手双螺旋形式存在，两条核苷酸链反向平行，且互为互补链。2).戊糖磷酸骨架在分子的外铡，在分子表面形成大沟和小沟，碱基堆积于螺旋内部.3).碱基间通过氢键相互
2、连接，A 和 T 以 2 个氢键配对，G 和 C 以 3 个氢键配对.4).螺旋中相邻碱基间相隔 0.34nm，每 10 个碱基对螺旋上升一圈，螺距为 3.4nm，直径为 2.37nm。4.描述蛋白质结构的不同层次；a. 一级结构：氨基酸通过肽键连接成一条多肽链（由肽键稳定）b. 二级结构：指多肽采取的不同构象，由不同氨基酸之间形成的氢键所稳定c. 三级结构：将多肽链的二级结构组分折叠成为三维构型而形成的（氢键，R 基团静电相互作用，疏水相互作用，二硫键）d. 四级结构：两条或更多已形成三级结构的多肽链组合在一起形成一个多亚基蛋白质。 （二硫键，氢键，疏水相互作用）5.正确区分编码 RNA 和
3、功能性 RNA；总 RNA编码 (4%)功能 （ 96%） _、 、 、 6.描述遗传密码的关键特征；1）共有 64 个密码子，每个密码子三联体(triplet)决定一种氨基酸；2)密码子具有方向性，例如 AUC 是 Ile 的密码子，A 为 5端碱基，C 为 3端碱基。因此密码也具有方向性，即 mRNA 从 5端到 3端的核苷酸排列顺序就决定了多肽链中从 N 端到 C 端的氨基酸排列顺序;3)密码子有简并性(degeneracy)一种氨基酸有几个密码子，或者几个密码子代表一种氨基酸的现象称为密码子的简并性。4)密码子有通用性，即不论是病毒、原核生物还是真核生物密码子的含义都是相同的。7.掌握
4、转录组学和蛋白质组学的一般研究方法，特别是 SAGE 技术、微阵列和基因芯片技术以及鉴定蛋白质相互作用的技术（噬菌体展示、酵母双杂交等） 。 研究转录组学的一般方法：1）基因表达系列分析（SAGE）：SAGE 技术不是研究完整的 cDNA，它产生长度 12bp 的短序列，每一条都代表了转录组中存在的一种 mRNA。2）DNA 微阵列技术DNA 微阵列技术指在固体表面（玻璃片或尼龙膜）上固定成千上万 DNA 克隆片段，或人工合成的寡核苷酸片段，用荧光或其他标记的 mRNA ,cDNA 或基因组 DNA 探针进行杂交，从而同时快速检测多个基因表达状况或发现新基因，快速检测 DNA 序列突变，绘制
5、SNP 遗传连锁图，进行 DNA 序列分析等的一种新技术。3）基因芯片技术主要包括四个主要步骤：芯片制备、样品制备、杂交反应和信号检测、结果分析 研究蛋白质组学的一般方法：1） 蛋白谱（两项技术：蛋白电泳+质谱）22） 蛋白印迹法（western 杂交）3） 鉴定与某一蛋白质相互作用的蛋白质a. 噬菌体展示：该技术采用了一种基于 噬菌体或某种丝状噬菌体的独特的克隆载体。将外源蛋白或多肽的 DNA 序列插入到噬菌体外壳蛋白结构基因的适当位置，使外源基因随外壳蛋白的表达而表达，同时,外源蛋白随噬菌体的重新组装而展示到噬菌体表面的生物技术。b. 酵母双杂交:双杂交系统使用缺乏某一报告基因相应激活因子
6、的酿酒酵母菌株，此时报告基因是不表达的。激活因子（转录因子）：一类控制基因表达的蛋白质，包含 DNA 结合结构域和转录激活结构域。4）蛋白质相互作用图谱第二章1.DNA 重组研究中所使用的不同类型酶的活性及主要作用1）末端修饰酶：改变 DNA 分子末端，为连接实验的设计增加可操作空间。a.碱性磷酸酶:去掉 DNA 分子 5端磷酸基团，从而阻止这些分子连接到其他分子上b.末端脱氧核糖核苷酸转移酶：属于模板非依赖的 DNA 聚合酶。c. T4 多聚核苷酸激酶：向 DNA 分子 5端添加磷酸基团，主要用于 DNA 分子的末端标记。2)DNA 聚合酶：以现有 DNA 或 RNA 分子为模板合成 DNA
7、 的酶3)DNA 连接酶 :通过 DNA 连接酶可以将限制性内切核酸酶消化产生的 DNA 片段重新连接起来，或者连接到一个新的分子上。2.明确 DNA 聚合酶的重要特征，区分基因组研究中所使用的各种 DNA 聚合酶重要特征：具备聚合酶功能，35 外切功能，和 53 外切功能（聚合酶 1 有，Klenow 没有）在进行 DNA 体外标记的时候 a.缺口平移法采用的是 DNA 聚合酶 1；b.末端标记法采用的是 Klenow 片段；c.随机引物法采用的 klenow 片段3.说明限制性内切酶切割 DNA 的方式按限制性内切酶的组成、是否具有修饰酶活性以及切断核酸的情况不同，限制酶分为三类：型型型a
8、. I 和 III 型限制性内切酶既能催化宿主 DNA 的甲基化，又催化非甲基化的 DNA 的降解，但切割位置不固定。b. II 型限制性内切酶只催化非甲基化的 DNA 的降解（无修饰酶活性） ，且具有识别位点的专一性和切割位点的专一性，一般在识别序列内切割，不需要 ATP 提供能量，是重组 DNA 技术中常用的限制性内切酶。4.区分平端与粘端连接平端：是通过限制性内切酶酶切后出现的片段末端是整齐配对的，这样再进行连接效率比较低。粘端：限制酶切后在末端出现两条带不一样长，这样就出现一个小尾巴，叫做粘性末端，再连接时，只要粘性末端配对互补就可以连上。5.提高平端连接的效率两条途径 a.一种方法是
9、将称为连接子或接头的小双链分子连接到钝末端。b.另一种方法是利用末端脱氧核糖核苷酸转移酶进行同聚物加尾，即在钝末端的 3末尾一个接一个地添加核苷酸。6.详述克隆载体的主要特征；并描述如何将这些载体用于克隆实验中（？）主要特征：a 它们都含有复制起始位点 b 能够自我复制 c 在原核生物中有表达的选择标记基因，具有多克隆位点。应用：1)以大肠杆菌质粒为基础的载体 puc 系列如 pUC8：宿主大肠杆菌菌株具有一个修饰的 lacZ 基因，该基因中缺失 lacZ部分，转化的宿主菌在含有氨苄和 x-gal 底物的培养基中培养，没有转入重组质粒的宿主菌不具有抗性不能生长，转入空载的宿主菌能将 x-gal
10、 分解成蓝色，转入目的基因的载体的宿主菌不能分解底物，底物仍然为白色，所以选择白班的菌落；2）建立在大肠杆菌噬菌体基因组基础上的克隆载体： 噬菌体基因组是一个线性分子，但其两个末端具3有 12 个核苷酸的单链突出，称为 cos 位点。cos 位点序列与 噬菌体的体外包装密切相关。两个 COS 之间长度只有在 37-52Kb 大小的时候才会被包装，否则就不会被包装，也就是说只有插入 3-18kb 大小的片段才会被包装，没有插入或插入过多都不会包装。7.列举用于克隆长片段 DNA 的载体，并评价每种载体的优缺点a. 考斯质粒（cosmid）：具有 cos 位点的质粒，与 噬菌体一样具有感染性，插入
11、片段可高达 44 kbb. 酵母人工染色体（YAC）：在 YAC 中，构成这些染色体组件的 DNA 序列与一个或多个选择性标记物，至少一个限制性酶切位点连接起来，酶切位点是为了插入新的 DNA，可用来克隆 600-1400 kb 的片段。缺点：一些类型的 YAC 载体有插入不稳定的问题，即克隆的 DNA 重排形成新的序列组合c. 细菌人工染色体（BAC ）：是基于天然的大肠杆菌 F 质粒构建的，能够克隆 300kb 及更长的片段，并且插入的片段很稳定；可以通过 Lac 筛选来鉴定重组体，是目前克隆大片段 DNA 最常用的载体。d. 细菌噬菌体 P1 载体: 与 载体相似，以天然 噬菌体基因组的
12、缺失形式为基础；P1 基因组比 基因组大，因此能克隆的 DNA 片段比 载体大；运用目前的技术可以克隆长达 125kb 的片段.e. P1 衍生的人工染色体（PAC ）: 综合了 P1 载体和 BAC 的特点，具有克隆长达 300kb 片段的容量f. Fosmids: 包含 F 质粒的复制起始位点和 载体的 cos 位点，有出现不稳定问题的倾向8.描述如何进行 PCR 反应。原理：DNA 的半保留复制。过程：1.DNA 变性（90-96）：双链 DNA 模板在热作用下， 氢键断裂，形成单链 DNA。2.退火（25-65）：系统温度降低，引物与 DNA 模板结合，形成局部双链。3.延伸（70-7
13、5）：在 Taq 酶（在 72左右，活性最佳）的作用下，以 dNTP 为原料，从引物的 5端3端延伸，合成与模板互补的 DNA 链。PCR 反应五要素：引物、酶、dNTP 、模板和缓冲液（其中需要 Mg2+)。第三章1.基因组测序需要借助基因组图谱的原因:由于串联重复 DNA 以及基因组范围内重复的存在，使得鸟枪法在对基因组较大的生物进行测序时发生偏差遗传图谱：指应用遗传学技术（遗传重组）构建的能在基因组上显示基因和其它序列特征位置的线性排列图，反映了基因或标记间的相对距离和顺序。cM物理图谱：指应用分子生物学技术直接分析 DNA 分子，从而构建的能显示包括基因在内的序列特征位置的图谱，它反映
14、了基因或标记间的实际距离。bp，kb，Mb2.描述用于构建遗传图谱的分子标记，以及每种标记是如何检测的1). 限制性片段长度多态性（RFLP）用限制性内切酶酶切基因组 DNA 时，在同一种生物的不同个体间出现含同源序列的酶切片段长度的差异。检测方法：southern 杂交，PCR 检测2). 简单重复序列(微卫星) 指重复单位相对较小（2-6bp 的基序） ，由于重复单位数目的变化而形成的多态性。检测方法：PCR+平板 PAGE 电泳和 PCR+毛细管电泳检测3).单核苷酸多态性（SNP）基因组中的某些位点上，有些个体只有一个核苷酸与其它个体不同，这种分散在基因组中的单个碱基的差异就称为 SN
15、P。检测方法：a. 通过寡核苷酸杂交分析检测 SNP 包括(1) DNA 芯片技术(2) 液相杂交技术 b. 通过耐扩增突变系统检测 SNP3.描述用于遗传作图的群体，以及它们是如何构建的用于遗传作图群体有暂时性分离群体包括 F2 和回交群体，永久性分离群体包括 RIL , DH44 掌握构建物理图谱的三种方法，特别是限制酶切图谱的构建方法和 STS 图谱的构建方法，并评价三种方法的优缺点物理作图的常用方法：1.限制性作图：在 DNA 分子上定位限制性内切酶酶切位点的相对位置；1)双酶解（double digest）Key：分析重叠片段2)部分酶解+完全酶解：比较分析这两种情况下的片段大小。3
16、)末端标记+部分酶解（具体步骤：1.利用放射性的同位素标记 DNA 的 3端或 5；2.端部分酶解 3.放射自显影优点：可用该技术构建原核生物和低等真核生物（酵母和真菌）等染色体较小的生物的限制图;缺点: 不能用于大型基因组。2.荧光原位杂交（FISH）：将分子标记与完整染色体杂交来确定标记的位置 (用于原位杂交的探针的标记要同时满足高灵敏度和高分辨率两个条件)优点：可直接显示标记序列在染色体或伸展 DNA 分子上的位置缺点：使用的中期染色体高度浓缩，只能进行低分辨率作图，确定新标记在染色体上的大概位置；操作较繁琐，数据积累速度太慢。3.序列标签位点（STS）作图：通过对批量的基因组片段进行
