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1、深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 公司在首家通过国际ISO14001 环境论证的 深圳高新技术园区内拥有近2000m2的GMP标准 生产厂房，其中包括严格按GMP要求建立的 450m2的洁净车间及其他辅助车间，是目前国内 第一家通过体外诊断试剂GMP认证的厂家。 GMP标准厂房标准厂房 （GMP-GMP-药品生产质量管理规范）药品生产质量管理规范） 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 1.1. 乙肝病毒乙肝病毒( (HBV)HBV)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光荧光定量定量检测试剂盒检测试剂盒 2.2. 人类免疫缺陷病毒人类免
2、疫缺陷病毒（HIV-1HIV-1）核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光荧光定量定量检测试剂盒检测试剂盒 3.3. 丙肝病毒丙肝病毒( (HCV)HCV)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 4.4. 结核杆菌结核杆菌( (TB)TB)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 5.5. 沙眼衣原体和淋球菌沙眼衣原体和淋球菌( (CT16/18)HPV6/11;16/18)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 人单纯疱疹病毒人单纯疱疹病毒( (HSV)HSV)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检试剂
3、盒荧光检试剂盒 弓形虫弓形虫( (TOX.)TOX.)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检试剂盒荧光检试剂盒 风疹风疹( (RUB.)RUB.)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 其他产品其他产品 解脲支原体解脲支原体( (UU)UU)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 乙肝病毒乙肝病毒( (HBV)YMDDHBV)YMDD突变核酸扩增突变核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 幽门螺旋杆菌幽门螺旋杆菌( (HP)HP)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光
4、检测试剂盒荧光检测试剂盒 肺炎支原体肺炎支原体( (MP)MP)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 EBEB病毒病毒( (EBV)EBV)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 梅毒梅毒( (TP)TP)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检试剂盒荧光检试剂盒 - -地中海贫血地中海贫血( (MA)MA)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检测试剂盒荧光检测试剂盒 苯丙酮尿症苯丙酮尿症( (PKU)PKU)核酸扩增核酸扩增( (PCR)PCR)荧光检试剂盒荧光检试剂盒 开发研制中的新产品开发研制中的新产品 深圳匹基生物技术
5、开发有限公司技 术支持部 新 药 试 生 产 转 正 式 生 产 批 件 乙型肝炎病毒（ HBV） 核酸扩增（PCR ） 荧光定量检测 试剂盒 国药准字 S20020033 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 PCRPCR基础基础 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 PCR-DNA体外复制 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 PCRPCR信号放大信号放大 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 PCR的特点 高灵敏度 高特异性 简便快捷 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 荧光荧光PCRPCR？ 荧光标记引物、探针或荧光标记引
6、物、探针或PCRPCR扩增扩增 产物产物 动态监测荧光信号变化动态监测荧光信号变化 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 荧荧 光光 染染 料料 光能光能 热能热能 转移给临近的分子转移给临近的分子 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 荧光荧光信号信号 荧光染料直接结合扩增产物 SYBR green I特异性结合双链，释放荧光信号 荧光标记引物 特异性荧光探针 Taqman双荧光标记探针 molecular Beacon荧光标记探针 荧光标记杂交双探针 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 FRETFRET？ 当某个荧光基团的发射谱与另一荧光基团的吸收光谱发当某个荧光基团的发射谱
7、与另一荧光基团的吸收光谱发 生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长生重叠，且两个基团距离足够近时，能量可以从短波长 （高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光（高能量）的荧光基团传递到长波长（低能量）的荧光 基团，这个过程称为荧光共振能量转移基团，这个过程称为荧光共振能量转移( (FRET),FRET),实际相当实际相当 于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。于将短波长荧光基团释放的荧光屏蔽。 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 TaqmanTaqman？ 特异性荧光 双标记探针 Taq酶 53外 切酶活性 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 Molecular bea
8、conMolecular beacon？ 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 荧光标记杂交双探针荧光标记杂交双探针 变性变性退火退火 延伸延伸 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 C CT T 值值样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数样本扩增曲线与阈值线交叉点的循环数 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 PCRPCR荧光试剂标准品扩增曲线荧光试剂标准品扩增曲线 （仪器：（仪器：Bio-Bio-rad iCyclerrad iCycler） 1x108 拷贝/ml 1x107 拷贝/ml 1x106 拷贝/ml 1x105 拷贝/ml 1x104 拷贝/ml 深圳匹基生物技术开发
9、有限公司技 术支持部 定量原理和方法 原理：每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的 对数存在线性关系，利用已知起始拷贝数的标准 品可作出标准曲线，最后通过标准曲线对未知模 板进行定量分析。 外标法：将几个已知拷贝数的纯化的目的基因标 准品进行FQ-PCR扩增，绘制荧光定量标准曲线。 内标法：将已知浓度的内标基因加到各标本中， 与标本一起经历核酸提取、加样、逆转录、PCR 扩增及信号检测的全过程，比较内标最后的实测 值与已知值，以检验标本中是否存在抑制PCR的 因素，也可对样品的拷贝数加以校正。 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 荧光PCR定量的原理-外标法 深圳匹基生物技术开发有限公司
10、技 术支持部 标准曲线定量 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 对数期分析与终点分析的比较对数期分析与终点分析的比较 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 荧光荧光PCRPCR重现性重现性 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 荧光荧光PCRPCR特点特点 l灵敏度高 l特异性强 l全封闭PCR过程，无需后处理 l采用dUTPUNG酶的防污染系统，有效降低污染机会 l即时反映扩增过程，摒弃终点数据，更适用于定量 l定量范围宽，可达到10个数量级，无须稀释样品 l可实现一管多检 l仪器自动分析，更快获得结果 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 竞争性荧光内标(IC) 定量PC
11、R技术 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 竞争性荧光内标竞争性荧光内标( (IC)IC) 什么是什么是IC?IC? Internal control简称IC，通常是指与靶序列十分相 似的一段DNA序列，两者在相同的条件下可被同一对引 物扩增，具有相同的扩增效率；区别在于两者的探针 结合区，可分别被不同序列的探针识别，通过探针的 不同荧光标记实现区分。 ICIC的作用的作用 监控PCR反应，避免样本抑制物、DNA（RNA）提取过程 的丢失、误操作等造成的假阴性结果；并对以上原因 造成的定量误差进行修正。 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 内标工作原理图内标工作原理图 深圳匹基生物
12、技术开发有限公司技 术支持部 荧光荧光PCRPCR 在临床诊断上的应用在临床诊断上的应用 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 荧光定量PCR的临床应用 早期诊断早期诊断 病情评估和预后判断病情评估和预后判断 抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导 新药验证新药验证 输血源的筛选输血源的筛选 母婴传播的控制与观察母婴传播的控制与观察 遗传疾病的诊断遗传疾病的诊断 肿瘤的诊断肿瘤的诊断 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 疾病的早期诊断疾病的早期诊断 免疫学诊断主要是抗原抗体反应，应用于临床通常在 体内产生抗体以后，而许多病原体的免疫学检测存在 较长的“窗口期”，比如HC
13、V的“窗口期”平均长达70 天，不利于对疾病的早期诊断；PCR方法直接检测病原 体的DNA/RNA，能大大缩短“窗口期”，其高灵敏度的 检测显然也有利于疾病的早期诊断。 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 HBV DNA与血清免疫学的关系 HBV DNA 与HBsAg/ HBsAb的关系 HBsAg（+）HBV DNA（-）：病毒基因的整合，此时只能表达HBsAg，而没有DNA 的复制；操作失误；PCR试剂的灵敏度不够。 HBsAg（-）HBV DNA（+）：“窗口期”；HBsAg 的水平过低无法检出，或者 HBsAg确已消失但病毒仍处于低水平复制状态；暴发性乙肝以合成HBcAg 为主，
14、 很少或不合成HBsAg；S区基因发生逃避免疫变异造成HBsAg阴性而HBV DNA阳性 ；血清亚型的漏检；老年人HBsAg检出率低于5%， HBsAb（+）通常表示病毒已清除。但已有报道HBsAb出现后血清内仍有DNA复制 ，尤其急性乙型肝炎感染窗口期HBsAb与HBV DNA同时阳性，但通常HBV DNA检出 率逐步下降 HBV DNA 与HBeAg/ HBeAb的关系 HBeAg阳性与HBV DNA有显著相关。HBeAg 阴转往往是HBV病毒血症的消失或炎症 的静息。通常认为HBeAg转阴继而出现HBe抗体的转化为乙型慢性肝炎好转稳定 的标志。事实上部分感染者中如慢性肝炎，HBeAg阴转
15、并不意味着炎症活动的停 止。HBeAg阴性的HBV感染；在另一部分感染者中如重型肝炎患者，主要以HBcAg 的表达为主，感染起始即为HBeAg阴性。 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 病毒感染窗口期的病毒感染窗口期的NATNAT检测检测 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 Lam et al - Hepatol 26: 226, 1997 对病毒感染的药物治疗中，免疫学指标的变化通常比 较滞后出现，且受个体差异影响较大，从而对临床判 断难以及时提供直接证据；而荧光定量PCR检测可直接 反映病原体滴度是否受药物治疗发生变化，从而为药 物疗效观察提供直接依据，以供治疗方案参考。同时
16、对不同治疗时间的用药剂量和用药时间提供依据。 抗病毒药物疗效的观察、指导抗病毒药物疗效的观察、指导 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 如HBV： 根据2000年拉米夫定临床应用指导意见，中国 慢性乙肝病人治疗的主要目的就是降低血清HBV DNA，诱导HBeAg血清转换等。 HIV: 目前用于治疗艾滋病的药物中主要就是抗病毒类药 物，因此，HIV RNA滴度的定量测定与抗HIV药物治 疗及疗效有着直接的关系。 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 乙型肝炎患者抗病毒药物治疗前后的HBV滴度比较 深圳匹基生物技术开发有限公司技 术支持部 新药新药验证验证 任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价任何一种抗病毒药物，以免疫标志物来评价 其疗效均不够敏感和及时，若以病毒复制的被抑制其疗效均不够敏感
