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1、北京中医药大学硕士学位论文脑缺血损伤级联反应原理与胆酸、栀子甙配伍作用机制的研究姓名：朱晓磊申请学位级别：硕士专业：中西医结合基础（病理学）指导教师：蒋玉凤20030601中文摘要中文摘要本论文由文献综述和实验研究两部分组成。文献综述包括脑缺血损伤级联反应的基础研究和针对脑缺血损伤级联反应和再灌注的中医药呀究两个部分。实验研究部分包括两方面的内容，部分是脑缺血损伤级联反应相关指标的时序性变化研究。选用健康雄性SD大鼠，体重330克左右，利用线栓法复制大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，取造模成功的大鼠随j盼成局灶陛脑缺血05h、lh、2h、6h、12h、24h、48h、72h、120h组，另设
2、假手术对照组。检测脑缺血大鼠脑组织匀浆总超氧化物歧化嗽SOD)、脂质过氧化产物丙二醛(MDA)在缺血不同时段的表达水平以探讨自由基及抗自由基与脑缺血损伤级联反应的关系，检测脑缺血大鼠脑组织匀浆上清液中TNFcc、IL1D、ICAM-1表达情况以探讨细胞因子与粘附分子介导的炎症反应与脑缺血损伤级联反应的关系，检测大鼠血浆vWF和血清NSE水平以特异胜反映脑缺血损伤级联反应中脑血管内皮细胞和神经元的损伤隋况。另部分取造模成功后的大鼠随机分成缺血12h、24h模型组和缺血12h、24h给药组(胆酸组、栀子甙组、胆酸与栀子甙配五组、清开灵垒方组和血栓通注射液组)，另设假手术对照组。研究给予中药治疗后大
3、鼠脑组织匀浆总超氧化物歧化N(SOD)、脂质过氧化产物丙c-g-(MDA)在缺血12h和24h两个时段的莉态水平，探讨中药对氧自由基损伤的保护作用。检测给予中药治疗后大鼠脑组织匀浆上清液中TNF一、IL-ID、ICAM-1表达情况以探讨中药对细胞因子与粘附分子介导的炎症戾应的治疗作用。检测给药后大鼠血浆vWF和血清NSE水平，观察中药对脑血管内皮细胞和神经元损伤的保护情况。并从形态学方面观察了胆酸、栀子甙及配伍对脑缺血24h和72hTNF-仅、ICAM-I和NSE表达的影响。在观察中药对脑缺血损伤级联反应的阻抑作用的同时，着重比较分棚旦酸、栀子甙与二者配伍对上述指标作用的特点，探讨药物组分配伍
4、的可能机制。实验研究结果一、脑缺血损伤级联反应相关指标的变化具有时序性1大鼠局烛陛脑缺血后05h，脂质过氧化产物MDA就开始有明显增多，并且在缺血05h到缺血lh、缺血48h至72h时产生了两次高峰，至缺血120h时仍然维持在高水平。而与之相对应的，超氧化物歧化酶SOD活力在大鼠脑缺血05h含量即显著阿氐，直到缺血120h仍显著f氐于正常。脑组织MDA的明显表达，表明有大量自由基形成，参与了脑缺血损伤级联反应，导致对脑血管内皮细胞和脑组织细胞的损伤。而SOD水平明显低于对照组，是一种清除自由基的过程中，SOD酶大量消耗，而酶活力显著降低的表现。2大鼠脑缺血1h后nBa蛋白含量开始升高，一直持续
5、到缺血120h。免疫组化染色显示假手术组TNF-c【表达为弱阳性，阳性细胞为部分神经细胞和胶质细胞。而缺血24h，模型组耵盯-c【表达阳性细胞明显增加，且增多的阳性细胞主要为小胶质细胞，可见部分神经细胞和腕贡细胞呈强阳性染色。缺血72h阳性绷包主要为小胶贡细胞，神经元茬达明显减少，但可见内皮细胞的表达，且与缺血24h比较，阳性细胞表达强度显著增加。脑缺血O5h脑组织IL-1p蛋白含量即开始升高，在缺缸0Sh到211_内维持在较高水乎，之后略有下降，在缺脯缺血损伤级联反应原理与胆酸、桅子甙配伍作用机制的研究血120hIL-1D蛋白含量再度升高，缺血O5h到120hIL-1D蛋白含量一直维持在较高
6、水平。检测1272h脑组织ICAM-1蛋白含量，发现缺血12hICAM-1蛋白含量络有显著升高，持续到缺血72h都有不同程度的表达。免疫组化显示假手术组ICAM-1表达阳性细胞为缸管内皮细胞，阳性血管数目较少，且呈弱阳性表达。而缺血24h和72h，模型组ICAM-1表达明显增加，阳性表达的血管数目增多，呈强阳性表达。TNF-c【、，lD、ICAM-1蛋白在缺血脑组织的表达，通过多种机割导致白细胞浸润和小胶质细胞激活，造成对缺血组织的损伤。表明炎陛细胞因子和粘附分子介导的炎症反应在脑缺血损伤级联反应中发挥了重要P用。3从脑缺血lh开始，大融缸浆娟毋含量持续升高，在24h到48h问含量升高达高峰，
7、之后略有下降，但到钝血120h仍维持在高水平。这说明脑缺血持续1小时后即可造成血管内度细胞的损伤，且随缺血时问的延长损伤程魔逐渐加重，到缺血2-3天时损伤最重，至缺血5天时|)表现为严重的损伤。由此可知，持续性MCAO可以导致严重的脑血管内皮细胞损伤，内皮细胞的损伤及vWF升高介导的血栓形成是造成缺血生织持续低灌流，能量缺乏从而诱发或加重脑缺血损伤级联反应的内在机制之一。而MCAO在脑缺血05h后血清NSE含量即有升高，提示脑缺血后即早期即有神经元损伤的生化改变，从缺血6h开始，NSE含量显著增加，至缺血48h时达到峰值，持续到缺血120h仍处于较高水平，说明从缺血函开始神经元损伤加剧，到第2
8、天时最严重，持续至缺血5天时仍存在较严重的神经元损伤。免疫组化染色可见假手术组NsE特异陆染色阳性细胞为神经元，细胞排列规则，显色均匀，密度高，结构完整，棕黄色阳性颗粒主要出现在胞浆部位。而缺血24h和72h模型组，NSE阳性细胞密度明显阿氏，散乱分布，排列不规律，浅棕黄色阳性颗粒弥散于阳性细胞胞浆内，呈弱阳性表达。这可能是因为脑缺血后，神经元损伤，使得细胞膜的完整陛受到破坏，胞浆内NSE释放到细胞外所致，血清NSE含量在脑缺血损伤后升高也支持这一点。(13见表1)-4损伤脑组织的形态学变化显示，HE染色见假手术组脑组织结构清晰、完整，皮层神经细胞密集，排列整齐。神经元咆浆丰富，淡染，胞核居中
9、，核仁清楚。血管内皮细胞完整、连接紧密，未见细胞粘附及嵌塞，管周组织致密。脑实质内未见炎细胞浸润。而缺血24h和72h模型组可见损伤的皮层神经元缺失明显，密度降低。神经绷包胞浆浓缩红染，胞核皱缩。胶质细胞增生、水肿。血管周围间质疏松，呈水肿样，间隙增大，炎细胞聚集于血管周围问质，内皮细胞受损，偶见血管内多形核白细胞粘附和嵌塞。脑组织内可见散在淋巴细胞浸润。对测半球皮层神经元结构基本正常，无明显神经元缺失及血管内皮细胞的病理改变。从形态学上显示了以线栓法复制MCAO模型引发的脑钝缸级联反应造成了缺血侧脑组织形态的严重破坏陛改变。二、药物对损伤反应的干穆i作佣及胆酸、栀子甙与二者配伍的作用比较1胆
10、酸可显著升高缺血1211和24h脑组织SOD活力，显著降低缺血12h和24h脑组织孙限cc蛋白及IL-1p蛋白含量，并可附始缺血12h时j血浆vWF和血清NSE的含量，在这些环节上均显示了有益作用(详见表2)。2栀予甙可升高缺血12h和24h脑组织SOD活力(缺血12h时升高作用更为显著)，还可显著降低缺血12h和24h脑组织仆Bo【蛋白及IL-1B蛋白含量，并可降低缺血12h年|a24h血浆vVF蛋白含量，在这些环节上均表咒为一定的治疗作用(详贼2)。但缺血24h时栀子甙组脑组织中MDA含量反较模型组升高，似有加重脂质过氧化反应的作用，有趣的是，中殳摘要此时段栀子甙对SOD活力的升高作用也不
11、如其在l2Il时的作用显著，其机制有待于进一步深入研究。3胆酸与栀子甙配伍后对缺血12h或24h的各卜指标皆可起到有益的作用(详见表2)，在对某些指标的干预上配伍表现出明显优于单用的效果。tw钦血24h时，胆酸、栀子甙对脑组织MDA含量并无显著有益影响，而栀子甙还有提高脑组织中MDA含量的作用，而二者配伍可以显著阿啪组织MDA含量，发挥保护作用。在对ICAM-1的干预A_dt现出相同的作用特征，即配伍使得原本无效的药物组分在这一指标上表现出显著的治疗作用。但是在对缺血24h血浆vWIF：含量的干预上，胆酸及其与栀子甙配缸并无显著作用，而栀子甙表现出治疗作用，配伍似乎减弱了栀子甙的治疗作用。在对
12、其余各时段指标的影响上，配伍并没有使单用药物组分的作用发生明显改变(详见表3)。4清开灵全方有降低脑24h时脑组织MDA含量和提升12h、24h时SOD活力(12h时更为显著)的作用，还可降低缺血12h、24h时脑组织ILlD蛋白含量(24h时更为显著)，在降低缺血24h时脑组织TNF-Gt蛋白含量、12ll和24h血浆vWF含量、12h血清NSE含量等方面作用显著(详见表2)。5血栓通注射液能显著降低脑缺血24h时脑组织MDA含量和提升12h、24h时SOD活力，对缺血12h和24h脑组织TNF-c【、IL-1p蛋白含量有显著降低作用，血栓通还可显著降低缺血12h血浆vWF含量，对缺血12h
13、血清NSE含量也有降低作用(详见表2X6免疫组化分析显示，24h和72tl，各用药组TNF-o表达强度较模型鲴减弱，其中缺血24h胆酸和栀子甙配伍组与模型组比较TNF-c【表达水平下降较为明显。脑24h，栀子甙组、配伍组与模型组比较，ICAM-I表达水平显著降低，而在缺血72h，各用药组ICAM-1表达与模型组并无明显的差异。就NSE表达而言，缺血24h和72h，配伍组和清开灵组的NSE表达阳性细胞增多，呈中等强度的阳陛袁达。其余给药组与模型组NSE表迟隋况无明显差异。上述结果表明，胆酸、栀子甙及二者配伍、清开灵、血栓通等都可不同程度地蹦印脑缺血损伤级联反应，但作用环节和靶点不g4咱IN，而且
14、药物发挥作用的时效也不尽相同，例如胆酸、胆酸和栀子甙配伍可以降低脑缺血12h血浆vWF含量，血栓通可以显著降低缺血12h血浆vWF含量，但是它们对缺血24h时段血浆vWF含量没有啊氐作用，药物对-血清NSE的影响也有类似的作用特征，这可能是由于上述药物对造成缺血12h时段内皮细胞和神经元损伤的主导机制具有拮抗作用，从而发挥了保护作用。而在缺血24h时可能由于药物组分化学特征的改变、药物组分问化学反应的改变、药代学、药动学的变化或造成缺血24h时段血管内皮细胞和神经元损伤的主导机制的改变，使得12小时作用于某靶点有效的药物24h时再作用于该靶点时不再有效。从全部实验结果来看，以胆酸和栀子甙配随作
15、用环节最广泛，效果也比较显著。产生这种现象的原因可能是由于药物配伍后化学组分上的相互作用，一种组分影响了另种组分的生物效应，也可能由于药物组分单用时作用于一个或多个靶点，在配伍时各靶点问的生物学关联胜使得组分配伍产生了与单用不同的效果，但具体机制仍有待于从化学和生物学方面进行深入探讨。二!二堕堕坐塑塑堡壁垦壁堕里兰旦壁二_查塑理望型型兰旦塑型塑!型表1实验捡测指标的时程变化特征、变E糊正检测指际、开始变化时间达变化高峰时间变化持续时间缺血O5Il到缺血lh慨含量缺血0，5ll缺血48h至缺血72Il缺血120hSOD活力缺血05h缺血120hTNF-c【含量缺血05h缺血05h缺血120hIL
16、-1D含量缺血05h缺血05h到缺血2h缺血120hICAM-1含量缺血12h缺血12h缺血72hvWF含量缺血lh铁血24h到缺血48h缺血120hNSE含量缺血O5h缺血骢h缺血12011表2药物对12h和24h各检测指标的影响I岿粝MDASOD田Fc【，16ICAM一1vWFNSE12h24h12h24h12h24h12h241112h24h12h24h12h24h药物胆酸无无显显显显有有无无有无有无效效效效效效效效效效效效效效栀子无力口显有显显有有无无有有无无甙效重效效效效效效效效效效效效二者无显显显显显有显显显有无有无配伍效效效效效效效效效效效效效效清开无有显有无显有显无无显显显无灵效效效效效效效效效效效效效效血栓无显有有显显显显无无显无有无通效效效效效效效效效效效效效效说明：无效指与同时段模型组比较无差异(Pal05)，有效指与同时段模型组比较有治疗作用(PO05)。缺血24h时，栀子甙组血浆vWF含量显著低于胆酸组(P01)，胆酸和栀子甙配伍组(P05k见表
