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1、1 关于数关于数字字 PCR PCR 发发展、原理、运用和前景展、原理、运用和前景 调查汇报调查汇报 2017 2017年年3 3月月 2 数字 PCR(digital PCR,dPCR) 技术是近年 来迅速发展起来的一种定量分析技术。与传统 定量 PCR 技术不同的是数字 PCR 不依赖于扩 增曲线的循环阈值(CT值)进行定量，不受扩增 效率的影响，也不必采用看家基因和标准曲线 ，是对起始样的绝对定量。 3 主 要 内 容 数字 PCR 的发展与原理 数字 PCR 的应用 3 1 2 数字 PCR 的前景展望 4 数字数字PCRPCR的发展与原理的发展与原理 20 世纪末，Vogelstei
2、n 等提出数字 PCR 的概念，通 过将一个样本稀释后分成几十到几万份甚至上千万份，然 后分配到不同的反应单元，每个单元不包含或包含一个或 多个拷贝的目标分子( DNA 模板)，在每个反应单元中分 别对目标分子进行 PCR 扩增，扩增结束后对各个反应单 元的荧光信号进行统计学分析。【1】 20062006年美国年美国 Fluidigm Fluidigm 公司率先推出第一款数公司率先推出第一款数 字字 PCRPCR产产基于基于 IFCIFC（integrated fluidic integrated fluidic circuitcircuit ）技术的）技术的 BioMarkBioMarkTM
3、 TM。 。 20092009年，年，BioTrove BioTrove 被被 Life Technologies Life Technologies (Applied Biosystems) (Applied Biosystems) 收购。收购。 QuantaLifeQuantaLife公司开发出的微滴数字公司开发出的微滴数字PCRPCR技术。技术。 该产品还获得了该产品还获得了20112011年度年度Frost & SullivanFrost & Sullivan北美新北美新 产品创新奖。同产品创新奖。同年年 Bio-Rad Bio-Rad 收收 购购 QuantaLife QuantaL
4、ife 的液滴数字的液滴数字 PCR PCR 技术技术(ddPCR)(ddPCR)，迅速推出，迅速推出 QX100 QX100 液滴数字液滴数字 PCR PCR 产品。产品。 5 6 传统 PCR 或定量 PCR 反应都是在 96 /384 孔 板中进行的，因此早期的 数字 PCR 技术也采用 96 /384孔板作为反应单元。 这远远不能满足数字 PCR 对反应单元数的需求，于 是开始制造微升和纳升级 别的反应室，在提高灵敏 度的同时减少了反应体系 的总体积。 1.微反应室/孔板数字 PCR 7 2.微流控数字 PCR 随着微流芯片技术的发展，数字 PCR 借助微流芯片， 可以把样本准确并且快
5、速的分成若干个独立的反应单元， 各个单元之间互不影响，可以多步反应同时进行。提高反 应通量的同时也降低了反应消耗成本。 8 3.微滴数字 PCR 微滴数字 PCR 借鉴了乳液 PCR，即将 DNA 模板与连接 引物的磁性微球以极低的浓度(比如单拷贝) 包裹于油水两 相形成的纳升至皮升级液滴中进行 PCR 扩增，扩增后的产 物富集在磁性微球上，收集破乳后进行测序。通过油水两 相间隔得到的以液滴为单位的 PCR 反应体系，比微孔板和 IFC 系统更容易实现小体积和高通量，而且系统简单，成 本低，因此成为理想的数字 PCR 技术平台。【2】 数字数字PCRPCR的应用的应用 9 数字数字 PCR P
6、CR 的前景展望的前景展望 n n发展空间大发展空间大 数字数字 PCR PCR 与传统与传统 PCR PCR 不同它有多种运作方式和原理，不同它有多种运作方式和原理， 数字数字 PCR PCR 技术还有很大的发展空间。在其运用方面，也技术还有很大的发展空间。在其运用方面，也 可有有很大的拓展空间。因为他是对核酸的绝对定量，是可有有很大的拓展空间。因为他是对核酸的绝对定量，是 一种更加直观、精确的一种更加直观、精确的 PCR PCR 技术，在未来的研究中，数技术，在未来的研究中，数 字字 PCR PCR 肯定会有更大的发挥空间。肯定会有更大的发挥空间。 10 数字数字 PCR PCR 的前景展
7、望的前景展望 n n高需求并有小众化趋势高需求并有小众化趋势 因为数字因为数字 PCR PCR 在各项领域的突出表现，数字在各项领域的突出表现，数字 PCR PCR 的需的需 求越来越迫切。例如：现在许多医疗机构提供求越来越迫切。例如：现在许多医疗机构提供DNADNA水平的水平的 疾病（主要为癌症）筛查服务，并为癌症患者提供靶向药疾病（主要为癌症）筛查服务，并为癌症患者提供靶向药 品，虽然国内只有少数医疗机构提供该服务，但是需要这品，虽然国内只有少数医疗机构提供该服务，但是需要这 项服务的人却很多。项服务的人却很多。 11 数字数字PCRPCR的前景展望的前景展望 n n发展中的难点发展中的难
8、点 成本高 通量低 对引物有要求 DNA 聚合酶质量要求高 严控污染 12 1林彩琴,姚波. 数字PCR技术进展J. 化学进展,2012, (12): 2 415- 2423. 2詹成,燕丽,王琳,金玉麟,陈力,时雨,王群. 数字PCR技术的发展和 应用J. 复旦学报(医学版),2015,(06):786-789. 3Holmberg RC,Gindlesperger A,Stokes T,et al.Akonni TruTip(R)and Qiagen(R) methods for extraction of fetal circulating DNA-evaluation by real-
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