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1、结核病细菌学检验的标准化 与新诊断技术进展 王甦民 2012年4月 强化结核病实验室诊断标准化的必要性 1、全球结核病控制的三大挑战：耐药 结核病、HIV/艾滋病合并结核病、移民（ 流动人口） 2、我国结核病疫情依然严重 3、目前结核病实验室诊断技术的不足 分类 结核分枝杆菌属原核生物界、厚 壁菌门、裂植菌纲、放线菌目、分枝 杆菌科的分枝杆菌属，分枝杆菌属种 类甚多，目前已命名的有200多种， 一般可分为缓慢生长和快速生长两大 类。 结核分枝杆菌特点 q结核菌生长缓慢，在一般培养基上 分裂一代需要10-20小时 q细胞壁厚度为1035nm，较一般细 菌的细胞壁厚，含有大量脂类，具有 坚韧性和疏
2、水性。 q抗酸性是分枝杆菌的重要特征。 结核病细菌学检查的重要作用 细菌学检查是结核病最客观、最科学 和最重要诊断方法和流行病学研究工具。 因此结核病的实验室检验仍然面临着较多 的问题。 细菌学检验存在的问题 不易于标准化 操作误差较大（可达到30%） 1、个人操作误差 2、标本性状 3、标本来源 对结果的理解差异可影响检验结果对 临床治疗的参考或指导意义。 主要的细菌学检验技术 1、痰涂片抗酸染色、镜检技术 2、分枝杆菌分离培养技术 3、分枝杆菌快速培养技术 4、药物敏感性实验技术 5、分枝杆菌菌种鉴定技术 标准的痰涂片抗酸染色、镜检技术 标本的收集，特别是痰标本的采集、 保存 制片和染色过
3、程的标准化 读片操作的熟练程度和标准化 对结果的理解 痰标本的采集、保存和运送 k脓样、干酪样或脓性粘液样痰为合格标本，痰 量应为3-5毫升。 k难以获得合格标本时，也应进行细菌学检查， 但应注明标本性状，以供分析结果时参考。 k容器上应注明与检验单一致的病人姓名、编号 及日期。 k不能及时检验的痰标本应置4C冰箱保存， k如需转运，外送前要认真核对检验单与痰瓶上 标注，放在专用的转运箱内运送。 标本的采集 标本留取方法 痰标本的留取应在医护人员的指导下进行 。医护人员应告知病人如何咳痰，合格的痰标 本是深呼吸后，由肺部深处咳出的分泌物，并 说明唾液检出的可能性很小。 检验人员检查痰标本的性状
4、，并在登记本 和检验报告单上注明（按干酪痰、血痰、黏液 痰和唾液分类登记）。 如何正确留痰 查痰对于结核病的诊断是非常重要的，通过痰检可以知道您是否痰 中带菌。如果痰中带有结核菌说明您患有肺结核，具有传染性，应该及时遵医 嘱治疗。 送检痰标本的质量直接影响检验结果的准确性。请您一定按照下 列要求和方法留取合格的痰标本。每个痰盒应分别留取12口痰，请不要将1口 痰分开放到2或3个痰盒中。 正确的咳痰方法： 1、咳嗽前应缓慢地深吸气，吸气后稍屏气片刻。 2、躯干略向前倾，两侧手臂屈曲，平放在两侧胸壁下部，内收并 稍加力。 3、咳嗽时腹肌用力快速收缩，使腹壁内陷。一次深吸气，可连续 咳嗽三声。 4、
5、停止咳嗽后，收缩腹肌将剩余的气体尽量呼尽。 5、重复缓慢吸气动作或平静呼吸片刻，准备再次咳嗽的动作。 * 注意：部分人如果忽然深吸气容易诱发咳嗽，您可以尝试缓慢或分几 次吸气，争取肺泡内充分充气，以增加咳嗽的效率。在这一过程中，要注意动 作的连贯性，一气呵成。同时，也可以叩击前胸，或由家属协助叩击后背胸壁 。这样震动支气管内的分泌物，能够增加咳嗽排痰的力度。 直接痰涂片检查法 萋尔-尼尔逊氏（ZiehlNeelsen）抗 酸染色法 （热染法） 细菌学常规检查 直接涂片法 操作流程 涂 痰 膜 自 然 干 燥 复 红 加 热 初 染 5 分 钟 自 然 干 燥 镜 检 流 水 冲 洗 美 兰 复
6、 染 30 秒 盐 酸 酒 精 脱 色 流 水 冲 洗 流 水 冲 洗 载玻片 （一）新载玻片必须经95%乙醇脱脂，检查无划 痕后 方可使用。 （二）一张载玻片只能涂抹1份痰标本。 （三）载玻片只允许一次性使用，严禁清洗后重 复用于AFB检查。 （四）载玻片正面一侧1/3处标注实验室序号(如 使用的载玻片一端无磨砂面，必须使用玻璃刻刀 注明编号；如使用的载玻片一端有磨砂面，可使 用2B铅笔在磨砂面上直接书写)。 （五）载玻片正面另一侧2/3中央处均匀涂抹成 面积为1020 mm的卵圆形痰膜。 染色 （一）严格按照操作规范完成染色程序 。 （二）染色后的痰膜应呈均匀亮蓝色， 无红色斑块。 （三）
7、将染色后的玻片放置在报纸上， 如果透过痰膜不能分辨报纸上的文字， 则表明该玻片涂抹过厚，或染色过程有 误。 （四）染色后的痰膜脱落部分应小于整 个涂抹面积的10%。 （一）为防止抗酸杆菌的交叉污染，严禁 油镜头直接接触玻片上的痰膜。 （二）仔细观察300以上的视野。 （三）每个工作日，一名镜检人员的玻片 阅读量一般不应超过25张。 （四）连续阅读1012张玻片后，应休息 20分钟左右。 镜检读片 痰涂片抗酸菌浓度与阳性结果机率 检出菌数 每毫升标本估算菌数 阳性结 果机率 0/100或更多视野 1000 10 1-2/300视野 5000 - 10000 50 1-9/100视野 约30000
8、 80 1-9/10视野 约50000 90（cv ） 1-9/每视野 约100000 96.2（ cv） 10或更多/每视野 约500000 99.95（ cv） 查痰次数与阳性机率关系 为什么诊断前强调三涂两培（3S 2C） 1 2 3 4 5 细菌学常规检查 直接涂片法 显微镜检报告方式： 0条/300视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阴性 1-8条/300视野：实报菌数 3-9条/100视野：萋-尼氏抗酸杆菌阳性（+ ） 1-9条/10视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（ 2+） 1-9条/1视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（ 3+） 10条/1视野： 萋-尼氏抗酸杆菌阳性（ 4+） 细菌学常规检查 直接
9、涂片法 注意事项： 选择痰标本中脓性、血样、干酪样的部分涂 片阳性率较高； 一张玻片只涂一份标本，玻片一次性使用， 防止交叉污染； 打开痰盒、涂抹痰膜时容易产生气溶胶，应 注意正确操作和自身防护； 石炭酸复红初染时必须加温。 细菌学常规检查 直接涂片法 优点： 是直接发现原菌的检查方法，适用于痰、尿 、便、体液、组织等几乎一切标本，有重要的临 床诊断价值。 是发现和确定传染源的重要途径，是考核和 评价疗效的重要指标，有重要的流行病学意义； 操作简便，价格低廉，适于各级实验室开展 ； 快速，数小时可报告结果。 细菌学常规检查 直接涂片法 缺点： a 敏感性低：通常每毫升含5000-10000条以
10、上 抗酸菌才可得到阳性结果； a 特异性较低：只能报告“抗酸菌阳性”，不 能区分结核和非结核分支杆菌； a 镜下只能观察菌体形态，不能辨别死、活菌 。 涂片镜检质量保证系统 室内质控 标本收集、染色液制备、涂片染色程序 、显微镜镜检、显微镜的保养和维护、结果 的报告和登记、痰片的分类保存等应按照国 家参比实验室的统一标准严格进行操作。 复查方式： 自查：试验员当日对已查涂片抽样复查。 互查：由本实验室其他试验员抽查当日10%涂 片。 涂片镜检质量保证系统室间质控 以现场和非现场督导为主要方式。 现场督导：质控实验室人员赴被质控实 验室就实验室布局、安全防护、污染物处理 、涂片染色操作、显微镜维
11、护状况、日常实 验记录等进行考核和指导，并以盲法、按比 例抽取涂片复查。 非现场督导：防治人员依据盲法、按比 例的原则抽取涂片交实验室复查。 复检玻片样本量 1.样本量估算：盲法复检的关键 是复检结果能否真正代表被督导实验 室的实际水平。世界卫生组织推荐 80%灵敏度、100%特异性（针对阴性 玻片）、误差为0的可接受数量以及 95%可信限样本量表，可以极大地减 少样本量，保证了盲法复检在统计学 意义上可以代表被评估实验室的总体 水平。 复检样本量计算表 上一年阴性 玻片的总数 玻片阳性率 2.5%5.0%7.5%10.0%13.0%15.0%18.0% 300185 129 101 80 6
12、7 59 50 400217 143 108 86 70 61 51 500243 154 114 89 71 62 52 700281 167 121 92 75 65 54 1000318 180 128 96 76 66 55 2000376 197 135 100 79 68 56 5000423 208 141 103 80 69 57 10000441 213 142 104 80 69 57 20000450 215 143 104 82 69 57 复检样本量计算表说明： a、玻片阳性率：指所有检测的玻片 中阳性玻片的比例（平均阳性率）。 b、上一年阴性玻片总数：每年玻片 的总
13、数减去全年阳性玻片数。 c、抽样时，当上一年阴性玻片数量 和玻片阳性率不在选择点，阴性玻片数 值采用区间上限，玻片阳性率采用区间 下限。 复检结果评价 盲法复检的目的不是为了验证某 个病人诊断正确与否,而是评价整个 实验室操作水平。评价的内容除了 玻片镜检结果存在的误差之外，还 包括检查标本的质量（合格标本与 不合格标本的比例）、涂抹的大小 和厚度、染色质量如何等,以便采取 纠正措施，提高实验室的工作质量 。 1.误差分类：分为定性误差和定量 误差 （1）定性误差包括高假阳性和高假 阴性 v 高假阳性（High False Positive HFP）：阴性片被错误地判读为2以上 的阳性。 v
14、高假阴性（High False Negative HFN）：2以上的阳性玻片被错误地判 读为阴性。 （2）定量误差包括量化误差、低假阳性和 低假阴性 v量化误差（Quantification Error ，QE） ：同一张阳性玻片初检者和复检者阳性判断级 别的差异。 v低假阳性（Low False Positive ，LFP） ：阴性玻片被错误地判断为1及以下的阳性。 v低假阴性（Low False Negative， LFN） ：1及以下玻片被错误地判断为阴性。 常见“误差”原因 误误差类类型 可能原因 建议议 假阳性 （FP） 1)例如染料沉渣或结结晶等被误识为误识为 抗酸 杆菌 2)原始
15、报报告后着色的抗酸杆菌退色 1）对对技术术人员员复训训。 2）对对假阳性玻片重新染 色并复检检。 假阴性 （FN） 1）观观察玻片的视视野数量不足 2）镜检镜检 技术术能力差 3）染色操作不规规范（抗酸杆菌颜颜色暗淡 、背景对对比不足或过过高） 4）显显微镜镜存在问题问题 5）染液质质量差 1、2、3）对对技术术人员员复 训训 4）现场检查显现场检查显 微镜镜工作 状态态 5）重新购购置质质量合格的 染料并重新配制染液 量化误误差 （QE） 1）观观察玻片视视野数量不足 2）阳性玻片的分级报级报 告标标准掌握差 3）镜检镜检 技术术能力差 4）显显微镜镜存在问题问题 1.2.3）对对技术术人员员复训训 4）现场检查显现场检查显 微镜镜工作 状态态 实验室诊断的新进展 1、扩大开展液体培养和药敏试验 2、引入现代分子生物学快速检测技术 3、引入现代免疫学快速检测技术 1、现代分子生物学检测主要技术 实时荧光定量PCR 环介导等温扩增基因检测 ( Loop mediated isothermal amplification， LAMP) 分子线性探针（Hain 技术） (2008WHO推荐) 基因芯片技术 GeneXpert MTB/RIF 快速诊断技术 （1.1）聚合酶链反应（PCR） PCR诞生于1985年，由美国 Muliis等 发明。PCR是一种根据脱氧核糖核酸（DNA
