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1、第二军医大学博士学位论文氧化高密度脂蛋白对内皮祖细胞功能影响及机制研究姓名：吴建祥申请学位级别：博士专业：内科学（心血管病）指导教师：吴宗贵梁春20100501氧化南密J迎脂生白刘内皮|I细胞功能影IJ向投机制川究摘要研究背景：高密度脂蛋白(highdensitylipoprotein，HDL)除了具有促进胆固醇逆转运、保护血管内皮、抗炎、抗氧化和抗血栓形成等多方面有益作用外，还有研究发现，HDL可以通过改善内皮祖细胞(endothelialprogenitorcells，EPCs)数量及功能，从而有助于血管损伤后的修复。然而，在许多情况下HDL水平升高却并不介导保护作用，相反会导致心血管事件
2、发生增加，造成这种现象的原凶可能在于升高的HDL并不具备心血管保护作用，此时“高水平HDL”反而促进心血管事件的发生。目前已知，在糖尿病、冠心病等条件下，HDL易氧化修饰生成氧化高密度脂蛋白(oxHDL)而发生功能逆转成为致病因素，但OXHDL对EPCs功能的作用以及机制如何并不清楚。研究目的：本研究旨在在前期有关EPCs研究的基础上，进一步观察OXHDL对EPCs功能的影响并探讨其中的作用机制，为针对HDL功能改善的治疗以及减少EPCs功能损害奠定基础。研究方法：首先采用密度梯度离心法从人外周血中分离、培养、鉴定得到EPCs。接下来，我们从三个方面研究OXHDL对EPCs功能的影响及机制：(
3、1)OXHDL对EPCs相关表面受体基因表达的筛选：采用人基因表达芯片检测OXHDL干预后EPCs基因表达的变化，并通过realtimePCR和WestemBlot方法进一步验证差异基因；(2)OXHDL对EPCs功能的影响：在第一部分研究结果的基础上，将EPCs分为对照组、HDL干预组(50ugm1)、不同浓度OX-HDL干预组(10ugmI、20ugml、50ugmi)、CD36中和抗体阻断组和CD36中和抗体阻断加OXHDL干预组，其中CD36中和抗体于干预前2小时提前加入，然后采用M1vr法检测细胞增殖情况、ANNEXINVPI法检测细胞凋亡水平、ROS荧光法检测细胞内氧化应激水平、T
4、ranswell小室迁移实验检测EPCs迁移能力、Matrigei方法检测体外血管形成能力，ELISA方法检测绌胞培养上清中的细胞凶子(VEGF和TSP1)，此外，通过结扎离断右侧股动脉建立裸鼠单侧下肢缺血模型，模型建立后通过尾静脉输注给予干预后的EPCs，继续喂养2周后采用血管造影、免疫组织荧光的方法观察EPCs体内血管修复能力。(3)OXHDL笫_一车医人学1蹲上学位论文对EPCs功能影响的信号通路研究：干预分组的情况同第二部分，在干预结束后，收集细胞总蛋白和核蛋白，采用WesternBlot方法检测MAPK通路(p38、JNK、ERK)相关蛋白的磷酸化水平，采用凝胶迁移实验(Electr
5、ophoreticMobilityShiftAssayEMSA)方法检测NFKB活性。研究结果：(1)OX-HDL对EPCs相关表面受体基因表达的筛选：OXHDL干预EPCs后，与细胞运输、转录调控、信号转导、应激反应、代谢、运动、分化、细胞周期、粘附等相关的基因表达均有变化，其中在与HDL或ox-HDL相关的受体中，OXHDL干预后CD36表达显著增加，为米干预组2375l倍，其余受体表达无显著变化。随后的realtimePCR和WesternBlot的结果进一步验证了OXHDL可以旱浓度依赖性促进CD36表达增加(P005)，而20ugml和50ugmloxHDLF预组迁移能力盟著降低(p
6、005)，此外，与50ugmlox-HDL干预组相比，预先给予CD36中和抗体可部分减轻oxHDL对EPCs迁移能力的抑制作用(p005)。(图2-2)黼缫黼鏊。I，少歹图2-2oxHDL对EPCs迁移能力的影响+与对照组柑比，p005#50ugmlox-HDL干预组相比，与p005叫oxHDL抑制EPCs体外血管形成与ox-HDL抑制EPCs迁移能力的结果相似，体外血管形成实验结果同样提示与对照组相比，HDL可咀促进EPCs休外血管形成，但两者并无统计学差异(咖05珊坤柏”0cLz荤oi一，：0_和HDL作用相反，oxHDL呈酿度依赖性抑制EPCs体外血管形成，但在较低浓度(10ugm1)时
7、抑制作州并不显著(口)005)，而20ugml和50ugmlox-I-IDL干预组体外血管形成能力显著降低(p005)，d：，l-，与50ugmloxHDL干预纽相比，预先给予CD36中和抗体可部分减轻oxHDL对EPCs体外血管形成能力的抑制作用(pO05)。(图23)AI图2-3oxHDL对EPCs体外血管形成能力的影响。与对照组相比，p005#50ugmlox-HDL干预组相比，与pO05五oxHDL对EPCs内ROS水平的影响实验结果显示，oNHDL呈浓度依赖性促进EPCs内ROS水甲，以50ugmloRHDL曲柏幻oll昌gp-毫SiLIB瓴高脂蛋自#m镕mn艟群目机制日究干预组作用
8、最为显著，顶先给千CD36中和抗体可部分减弱oxHDL对EPCs内ROS水平的促避作Hj(p锄05)。(图2_4)口目II。I。I囤2_4oxHDL对EPCs内ROS水甲的影响与对照组相比，p005#50ugmlox-HDL干预纽相比，与p005六ox-HDL抑制EPCs体内血管新牛能力裸鼠下肢缺血模型建立后，注入培养基的对照组病变最为显著出现了下肢缺血坏死，给予EPCs注入纽缺血状况明显改善，而oxHDL干预的EPCs注入后虽然缺血状况有一定的改善，但较未干预EPCs组的改善状况要差，预先给予CD36中和抗体娃理的ox-l-IDL干预组的改善状况有所好转。血管造影结果显示，与对照组相比，注入
9、EPCs组的血管密度显著增加(p005)，然而给予oxHDL刺激的EPCs组较未给予任何干预的EPCs组血管密度有所降低，m田钟船帕O-，宴jii磊oE目，号；ll第一fK人博十t女预先给_rCD36中和抗体处理则町以部分减轻oxHDL的损害作用(p005)。免疫荧光的结果与造影结果类似。(罔2-5)一“I一+I一踟瑚mm轴oIIo_ouJo。=蠡蚝餮扩氧化高密度脂蛋白对内皮祖细胞功能影响及机制研究图25OXHDL对EPCs体内血管新牛能力的影响幸与对照组相比，p0。05，#50ugmlOXHDL干预组相比，与p005七OXHDL对血管新牛相关因子表达的影响TSP1和VEGF是两个主要的影响血
10、管新生的因子，两者作用相反，VEGF可以促进血管新生，而TSP1则抑制血管新生。研究结果表明，OXHDL干预24小时后，TSP1表达在mRNA和蛋白水平均呈浓度依赖性升高(p005)，而HDL则仅在mRNA水甲降低TSP1表达。此外，HDL可以促进EPCs表达VEGF(pO05)，而与对照组相比，不同浓度的OXHDL干预组VEGF表达无统计学差异(p005)。(图26)41娜瑚珊瑚伽伽卯o00皇-口uJoo一=o重胄胃uE锄钮221，t-，曩lIlA皇ollPJI毒兰8-dS工第一二军医人学博士学位论文421为111柏11加一：6dlB考焉暑-8=8山。山，、靳靳o1110a暑；uJolC-芍
11、贺o-b每z笆：。窃卜，钒化I=】密J蔓忻尘自刈内皮H细J也助能影响歧机制川宄D150枷SOO歹，歹，p。，图2-6OXHDL对EPCs表达血管新生相关因子的影响毒与对照组相比，p005，#50ugmlOX-HDL干预组相比，与p005讨论本部分实验中，我们在前一部分基因表达芯片结果的基础上，进一步采用AnnexinVPI流式检测、Transwell小室迁移、westernblot、realtimePCR、裸鼠单侧下肢缺血、ELISA等方法观察了OXHDL对EPCs增殖、凋亡、迁移、体外血管新生、体内血管修复和分泌细胞因子等功能的影响，并研究CD36在该影响过程中的作用。研究结果显示OXHDL
12、里浓度依赖性促进EPCs凋亡，抑制其迁移、体外血管新生以及裸鼠肢体缺血后体内血管修复能力，促进EPCs内氧化应激水平，而对血管新生相关冈子的影响主要表现在促进TSP1表达及分泌，但对VEGF表达影响不显著，这些损害作用在预先给予CD36抗体处理后均有部分减轻。血管损伤是糖尿病血管并发症、冠心病等多种疾病的病理基础，血管损伤修复对于这些疾病的进展及预后等均具有重要影响。近年来，循环内皮祖细胞在血管损伤的修复中作用已经引起重视，目前认为循环EPCs的数量及功能是反映血管功能的生物43蕾营-=口o|oo一=oi。I|【I)(曾z三uu第_军医人学博J学位论史标志。EPCs的数量及功能易受多种因素的影
13、响，在糖尿病、冠心病等患者中，EPCs不仅数量较健康人群减少，其增殖、迁移、粘附和成血管能力也显著降低。m其中有研究发现，氧化低密度脂蛋白(ox-LDL)可通过LOXl、eNOS等途径促进EPCs凋亡及损害EPCs迁移、粘附等功能。213与低密度脂蛋白相反，高密度脂蛋白通常被认为具有心血管保护作用，研究发现，除了促进胆固醇逆转运外，HDL还具有包括保护血管内皮、抗炎、抗氧化和抗血栓形成等多方面有益作用。M因而，提高HDL水平成为重要的临床治疗目标。然而，2007年以提高HDL水平为目标的ILLUMINATE试验等大规模临床研究结果表明，torcetrapib(CETP抑制剂)干预后HDL水平升
14、高，但主要心血管事件和心血管死亡率反而增加，15。7除了药物本身引起血压升高等靶外效应外，造成这种现象的原因可能还在于升高的HDL并不象预期的那样具备心血管保护作用。同样，2009年，Sorrentino等发现与正常的HDL作用相反，从糖尿病患者体内分离得到的HDL反而会抑制EPCs的功能，影响血管修复。4这些结果提示：除了关注HDL“量”(水平)之外，需要更加关注HDL的“质”(功能)。已有研究发现，在糖尿病、冠心病等情况下，HDL会发生修饰，导致结构、成分及功能发生改变，产生失功能HDL，造成其有益作用减弱甚至成为致病凶素。其中氧化修饰最为常见并且具有重要意义，多项研究证实OXHDL在体内
15、存在，氧化修饰后其心血管保护作用减弱甚至发生了逆转而成为致病因素。s9与HDL结构及构成改变相对应的是氧化修饰后HDL的功能也随之发生改变。ox-HDL功能的改变主要包括：(1)RCT功能减弱。研究证实，与未修饰的HDL相比，修饰的HDL通过ABCAI和SRBI介导的RCT减少。18，19(2)抗炎抗氧化作用基本丧失，甚至促进炎症和氧化应激发生。(3)内皮保护作用下降，修饰后HDL对ENOS、NO的促进作片j降低，甚至促进单核细胞迁移粘附和内皮细胞凋亡。20此外，OXHDL还可以通过CD36途径介导激活血小板，促进血栓形成。21此次我们的结果则提示，OXHDL对EPCs功能的影响较正常的HDL也发生了逆转，损害EPCs功能这可能是OXHDL功能逆转成为致病因素的又重要机制。正如我们第一部分芯片结果所示，与HDL主要通过SRBI受体途径发挥作用不同，OXHDL干预之后SRBI变化不显著，而表达变化最为显著的是CD36，以往一44氧化南密J迂稻血自刘内J乏f141缒功能影响技机制埘究已有文献证实CD36为ox-HDL的受体，OXHDL可能通过CD36介导细胞内信号传导通路，继而影响EPCs的功能。22CD36属于清道夫受体B家族，是一种跨膜糖蛋白，在内皮细胞、单核臣噬细胞、血小板等都有表达，可以与凝血酶敏感蛋白l(thrombosp
