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1、不同杀菌剂对根尖外多细菌生物膜作用的不同杀菌剂对根尖外多细菌生物膜作用的 体外研究体外研究 于丁一 培养类别全日制 学位类型专业学位 一级学科(专业类)口腔医学 二 级 学 科 ( 专 业 )口腔临床医学 研究方向牙体牙髓病学 指导教师余擎 教授（主任医师） 培养单位口腔医院牙体牙髓病科 二 O 一四年五月 分类号R781.3 U D C616.31 密级公开 独独独独 创创创创 性性性性 声声声声 明明明明 秉承学校严谨的学风与优良的科学道德，本人声明所呈交的论文是我个人在导 师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和 致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或
2、撰写过的研究成果，不包含本人或 他人已申请学位或其他用途使用过的成果。与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了致谢。 申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。 论文作者签名：日期： 保保保保 护护护护 知知知知 识识识识 产产产产 权权权权 声声声声 明明明明 本人完全了解第四军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在校攻读学 位期间论文工作的知识产权单位为第四军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文 等使用本论文工作成果时第一署名单位仍然为第四军医大学。学校可以公布论文的 全部或部分内容（含电子版，保密内容除外） ，可以采用影印，缩印或其他复
3、制手段 保存论文；学校有权允许论文被查阅和借阅，并在校园网上提供论文内容的浏览和 下载服务。同意学校将论文加入中国优秀博硕士学位论文全文数据库和编入中 国知识资源总库等，并可浏览和下载，同时享受中国优秀博硕士学位论文全文 数据库出版章程规定的相关权益。 论文作者签名：导师签名：日期： 第四军医大学硕士学位论文 目目录录 缩略语表 1 中文摘要 2 英文摘要 4 前言 7 文献回顾 9 正文17 实验一根尖多细菌生物膜的培养17 1 材料 17 2 方法 18 3 实验结果 20 4 讨论 21 实验二不同杀菌液对多细菌生物膜作用的研究 24 1 材料 24 2 方法 24 3 实验结果 26
4、4 讨论 27 小结31 参考文献32 附录38 临床病例汇报47 个人简历和研究成果52 致谢53 第四军医大学硕士学位论文 -1- 缩略语表缩略语表 缩略词缩略词英文全称英文全称中文全称中文全称 ATCCAmerican Type Cultrue Collection美国标准株 BHIBrain Heart Infusion牛心脑浸液培养液 CHXchlorhexidine洗必泰 MBCminimal bactericidal concentration最小杀菌浓度 MICminimal inhibitory concentration最小抑菌浓度 NaClOsodium hypochlo
5、rite次氯酸钠 rHBD-3recombinant human beta defensin3重组人防御素-3 SAEWstrong acid electrolyzed water强酸性电解质水 16srDNA16S ribosomal DNA16S 核糖体 DNA 第四军医大学硕士学位论文 -2- 不同杀菌剂对根尖外多细菌生物膜作用的不同杀菌剂对根尖外多细菌生物膜作用的 体外研究体外研究 硕士研究生：于丁一 导师：余擎教授 辅 导 教 师：田宇副教授 第四军医大学口腔医院牙体牙髓科，西安 710032 中文摘要中文摘要 根尖周病是口腔临床的常见病，目前最有效的治疗方法是根管治疗术，其原理 是
6、清除根管系统内的感染，从而促进根尖周病变组织的愈合。临床中有一些由于解 剖结构复杂、感染微生物种类特殊等原因会导致根管治疗失败，这些病例绝大多数 可以通过根管再治疗术或根尖外科手术得到解决。其中，某些病例出现根尖外的微 生物感染，形成根尖外生物膜，就必需通过根尖切除倒充填的外科手术方法进行治 疗。为了能够彻底去除根尖外生物膜，根尖外科手术要求切除根尖约3mm的牙体组 织，这样势必会影响牙齿的抗力。能否采用物理、化学的手段（非机械切除）清除 根尖外生物膜，从而达到既能清除感染，又能最大限度地保留牙体组织的目的呢？ 国内外学者往往将这种通过根管治疗、甚至再治疗都难以控制的根尖周病称为 难治性根尖周
7、病，研究表明衣氏放线菌、血液链球菌、粪肠球菌均为革兰阳性兼性 厌氧菌，在难治性根尖周病的根尖生物膜内能够检出，放线菌能造成慢性的根尖放 线菌病，血链球菌是牙周和心脏疾病中常见的细菌。粪肠球菌的耐受力和抵抗性强， 所以在难治性根尖周病中亦是常见菌，在临床切除的根尖组织或拔除的患牙根尖部 的微生物学研究结果显示，难治性根尖周病往往根尖外生物膜是以这三种细菌为主 的混合细菌生物膜。 第四军医大学硕士学位论文 -3- 强酸性电解质水（SAEW） 、次氯酸钠（NaClO） 、洗必泰（CHX)，是临床根管 治疗中常用的根管内消毒溶液，强酸性电质水是电离分解盐水得到，生物相容性较 好。次氯酸钠是有很强杀菌并
8、破坏分解细菌和有机物质的化学药品，广泛的在根管 冲洗中使用。洗必泰和次氯酸钠能力相似，但杀菌作用稍弱，在漱口水的成分中常 可见到。人防御素-3（rHBD-3）为一种宿主防御肽，是新型的杀菌药物，可杀灭 多种细菌，特别是耐药菌，但作为杀菌液使用的报道还不多。这几种杀菌剂虽然有 报道能分别杀灭或抑制体外单独培养的上述三种细菌，次氯酸钠、洗必泰和强酸性 电解质水还能有效清除根管内的生物膜，那么它们和新型的人防御素-3 能否清除 根尖外生物膜，尤其是三种细菌混合的根尖外生物膜呢？迄今为止仍鲜见报道。因 此，我们试图探索三种细菌共培养的体外模式，建立根尖牙骨质上三种细菌的混合 生物膜，并观察次氯酸钠、洗
9、必泰和强酸性电解质水以及人防御素-3 对根尖牙骨 质上混合细菌生物膜的作用，为难治性根尖周病的治疗提供新的临床思路。研究分 两部分： 一一根尖多细菌生物膜的培养根尖多细菌生物膜的培养 先将三种细菌， 血链球菌、 粪肠球菌、 衣氏放线菌， 分别在1/2牛心脑浸液（BHI） 琼脂培养基和BHI培养基中中进行共同培养， 观察三种细菌形成的菌落间是否有相互 抑制。之后将三种菌接种在96孔板上，结晶紫染色观察生物膜的生长情况取96孔板 将置于37厌氧培养箱中进行培养48h用结晶紫染色法观察单菌种生物膜成膜情况， 分别于培养后24、48、54、56、58、70、76、82、94、106小时，每个时间点终止
10、培 养，用三蒸水冲洗3次后每孔加入250l的乙醇溶液固定30min；固定结束后弃原液， 分别用1g/L结晶紫染色 5min ； 330ml/L冰醋酸洗去染液后， 用酶标仪分别测定570nm 波长处的OD值，观察生物膜的生长曲线。三种细菌共同在根尖牙骨质片上培养5天 后，用25ml/L戊二醛溶液在4固定过夜，500ml/L、600ml/L、750ml/L 850ml/L、 950ml/L、1000ml/L乙腈梯度脱水、干燥、喷金、扫描电镜观察并拍照。以上实验提 示三种不同的细菌可以共同良好的生长，接菌顺序和方法会对其生长有一定影响。 二二不同杀菌液对多细菌生物膜作用的研究不同杀菌液对多细菌生物膜作用的研究 第四军医大学硕士学位论文 -4- 在上一实验的基础上，对接种好的牙
