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1、细胞器的分离、纯化细胞 分级分离法 2010级生物技术 冯德 实验目的 v认识离心机，学习离心机的使用方法 v学习细胞器的分离及纯化的一般原理和方法 实验原理 v 离心技术是借助于离心机旋转所产生的离心力，根 据物质颗粒的沉降系数、质量、密度及浮力等因子 的不同，而使物质分离的分离分析技术。 v细胞分级分离法是一种通过离心从而分离细胞内不 同结构成份的细胞器(包括核、叶绿体、线粒体、微 体等)以研究其形态结构，化学组成成份和生理活性 的方法。 v这个方法包括匀浆化，分级分离，分析三个步骤。 通过匀浆化得到细胞匀浆液；把匀浆液放在一定的 液体环境下，在离心机中进行离心分离处理。因为 离心力的作用
2、，可以把细胞内比重和大小不同的各 种结构分开。 v匀浆化：在蔗糖和其它的溶液中将细胞进行机械破 碎。这就是细胞匀浆化，而破碎物为细胞匀浆 。 v分级分离：利用匀浆各组分的大小、形状、密度等 的不同来将其分离。 v分析：对用这样方法得到的分离物进行化学分析， 可以大大丰富细胞各种组分的结构和机能的知识。 细胞器的沉降速度取决于辐射向外的离心场，我们通 常用相对离心场表示 相对离心场 vRCF = 1.11 x 10-5 (n)2 r RCF表示相对离心场 n（rpm）表示离心机每分钟的转数 r 表示离心半径，即离心机转轴中心与离心管中心的距离 由于离心管的位置由转（rotor） 决定，因此r 必
3、须由查阅相关转子 的参数而得。 差速离心法 从低速到高速逐级沉淀分离，使较大的颗粒先在较低转 速中沉淀，再用较高转速将原先悬浮在上清液中的较小颗粒 分离沉淀下来，从而使各种亚细胞组分得以分离。 差速离心法主要用于分离细胞器和病毒 v优点：操作简单，离心后用倾倒法即可将上清夜 与沉淀分开，并可使用容量较大的角式转子。 v缺点：分离效果差，不能一次得到纯颗粒； 壁效应严重，特别是当颗粒很大或浓度很高时， 在离心管一侧会出现沉淀；颗粒被挤压，离心 力过大、离心时间过长会使颗粒变形、聚集而失 活。 普通离心机 高速低温离心机 实验用品 (一)材料：新鲜菠菜 (二)器械：显微镜、高速低温离心机、普通离心
4、机、离心管、 200目的尼龙网、漏斗、烧杯、组织研磨器等。 (三)试剂 l、线粒体离心匀浆介质 2、1詹纳斯绿 B的0.25M蔗糖溶液。 3、0.05M TrisHCL液体 PH 8.0 0.02M Tris 55ml 0.1N HCI 55ml 蒸馏水200ml 4、0.35mol/lNaCl 菠菜叶叶绿体的分离 取去叶脉的新鲜菠菜5g于研钵内，加入0.35mol/L NaCl 15ml研磨 绿色的匀浆液用尼龙网（200目）过滤，滤液分别转入两只干净的离心管 1000rpm离心4min，除去沉淀 上清液在高速低温离心机上以3000rpm离心5min，所得沉淀即为叶绿体 用0.35mol/L NaCl液稀释，置冰箱中保存备用 在干净的载玻片上，滴一滴叶绿体悬液，加上盖玻片，于显微镜下观察
