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1、 暨 南 大 学 硕士学位论文 环境镉暴露人群环境镉暴露人群尿液中尿液中小分子代谢产物表征差异研究小分子代谢产物表征差异研究 A Study on Differential Characterization of Urinary Micromolecular Metabolites Associated with Environmental Cadmium Exposure 作者姓名：汤柳英 指导教师姓名：杨杏芬 教授 学科、专业名称：流行病与卫生统计学 答辩委员会主席： 论文评阅人： 学位授予单位和日期： 暨南大学医学院 二零一四年五月 独独 创创 性性 声声 明明 本人声明所呈交的学位论文
2、是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得暨南大学或其他教育机构的学位或 证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： 签字日期： 年 月 日 学位学位论文版权使用论文版权使用授权书授权书 本学位论文作者完全了解暨南大学暨南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 鉴鉴。 本人授权暨南大学暨南大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库
3、进行检 索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 学位论文作者签名： 导师签名： 签字日期： 年 月 日 签字日期： 年 月 日 学位论文作者毕业后去向： 工作单位： 电话： 通讯地址： 邮编： 暨南大学硕士学位论文 环境镉暴露人群尿液中小分子代谢产物表征差异研究 英文缩略词汇表英文缩略词汇表 缩略词缩略词 英文名称英文名称 中文名称中文名称 WHO World Health Organization 世界卫生组织 JECFA Joint Expert Committee on Food Additives 食品添加剂联合专家委员会 IARC International Ag
4、ency for Research and Cancer 国际癌症研究中心 ATSDR Agency for Toxic Substances and Disease Registry 美国毒物和疾病登记署 NMR Nuclear Magnetic Resonance 核磁共振 GC-MS Gas Chromatography-Mass Spectrometer 气相色谱串联质谱仪 LC-MS Liquid Chromatography-Mass Spectrometry 液相色谱串联质谱仪 UPLC-MS Ultra Performance Liquid Chromatography tan
5、dem Mass Spectrometry 超高效液相色谱串联质谱仪 HPLC-Q/TOF High Performance Liquid Chromatography tandem Quadrupole/Time of Flight 高效液相色谱串联四级杆飞 行时间质谱仪 ICP-MS Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry 电感耦合等离子体质谱仪 ESI Electrospray Ionization 电喷雾电离源 U-Cd Urinary Cadmium 尿镉 NAG N-acetyl-D-amino glycosidase enzyme
6、 N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶 2-MG 2-microglobulin 2微量球蛋白 1-MG 1-microglobulin 1微量球蛋白 RBP Retinol Binding Protein 视黄醇结合蛋白 MT Metallothionein 金属硫蛋白 PCA Principal Component Analysis 主成分分析 PLS Partial Least Squares 偏最小二乘 PLS-DA Partial Least Squares Discriminant Analysis 偏最小二乘-判别分析 OPLS-DA Orthogonal Partial Least-S
7、quares Discriminant Analysis 正交偏最小二乘判别分析 ROC Receiver Operating Characteristic 受试者工作特征 AUC Area Under The Curve 曲线下面积 RSD Relative Standard Deviation 相对标准偏差 QC Quality Control 质量控制 暨南大学硕士学位论文 环境镉暴露人群尿液中小分子代谢产物表征差异研究 I 1环境镉暴露人群 环境镉暴露人群尿液中尿液中小分子代谢产物表征差异研究小分子代谢产物表征差异研究 摘摘 要要 环境镉污染对机体健康损害研究一直是近几十年来公共卫生领
8、域研究的热 点问题。资料显示，镉为已知的最易在体内蓄积的毒物之一，长期镉暴露与肾脏 损伤、 骨骼损害、 心血管疾病等存在正相关关系， 镉暴露是众多损害的危险因素， 其导致患者死亡率增加， 尤以女性更甚， 肾损害是镉暴露引起的最早期关键效应。 在镉的健康损害效应研究中， 国际上将尿镉作为公认的内暴露指标以反映体 内镉负荷水平，尿2-MG、NAG等效应性生物标志物作为早期肾损伤监测指标， 被广泛应用，是镉中毒人群临床诊断和治疗的重要参考依据。 人们对于镉的生理代谢过程仍知之甚少， 对镉的健康危害的机理仍有许多未 明之处。本研究拟采用代谢组学法，探索环境镉长期暴露人群尿中显著变化的小 分子代谢产物，
9、从代谢途径角度寻找环境镉暴露对机体健康损害的证据，为进一 步寻找环境镉暴露健康损害相关的生物标志物提供线索。 研究目的研究目的 探索环境镉长期暴露人群尿中显著变化的小分子代谢产物， 为寻找环境镉暴 露健康损害相关的生物标志物提供线索。 研究方法研究方法 1. 流行病学调查流行病学调查 1.1 调查对象调查对象 根据历史资料和研究目的，选择某环境高镉矿区作为环境镉暴露区，选择无 明确重金属污染史，与暴露区经济水平相当、居民生活条件和生活习惯相似的地 区作为对照区进行现场调查。选择本地居住时间 15 年以上，以居民家中自产大 本研究受到以下项目资助： 国家自然科学基金 （项目编号： 8127310
10、2） ； 卫生公益性行业科研专项 （项目编号： 201302005） ； 广东省自然科学基金（项目编号：S2011010004984） 。 暨南大学硕士学位论文 环境镉暴露人群尿液中小分子代谢产物表征差异研究 II 米和蔬菜为主要食物来源的 45-70 岁女性为调查对象，排除肝肾疾病及慢性代谢 性等疾病。 1.2 样本的采集、运输及保存样本的采集、运输及保存 大米和蔬菜的采集、运输及保存大米和蔬菜的采集、运输及保存 采集调查对象当季家中自种自食大米和叶类蔬菜各一份，统一编号并记录； 统一将收集的大米和新鲜蔬菜迅速送至实验室，分析前储存于-4 冷库。 尿样的收集、运输及保存尿样的收集、运输及保存
11、 收集调查对象空腹晨尿贮存于冷藏箱中，迅速送至实验室，分装至冻存管用 于相关分析；尿镉、肌酐、2-MG 和 NAG 检测工作在样品收集后 8 h 内完成； 进行 HPLC-Q/TOF 检测的尿样储存于-80 低温冰箱中。 1.3 检测指标及方法检测指标及方法 外暴露指标外暴露指标 以大米和蔬菜镉含量作为外暴露指标，采用 ICP-MS 进行检测。 内暴露指标内暴露指标 以尿镉作为内暴露指标，采用 ICP-MS 进行检测。 肾损伤生物标志物肾损伤生物标志物 以尿肌酐、NAG 和 2-MG 作为镉暴露相关的肾损伤生物标志物，采用苦味 酸法测定尿中肌酐含量，采用免疫比浊法检测尿中 2-MG 和 NAG
12、 的含量。 2. 尿液代谢组学分析尿液代谢组学分析 2.1 代代谢组学分析技术平台谢组学分析技术平台 样本前处理样本前处理 尿样室温下解冻后涡旋 2min，移取 100L 加入配置内标溶液，充分混合后 离心 10min，移取上清液后再次离心，将二次离心获得的上清液上机分析。 液相色谱条件液相色谱条件 采用 C18反相色谱柱，柱温保持在 50，一次进样量为 5 L；流动相 A：纯 水+0.1%甲酸，B：甲醇+0.1%甲酸，流速 0.4 mL/min，执行梯度洗脱程序。 质谱条件质谱条件 电离源： ESI， 毛细管电压： 3500 V， 干燥气温度： 350 ， 流速： 10.0 L/min-1，
13、 雾化压力：30 psi，质荷比（m/z）检测范围：501000。 暨南大学硕士学位论文 环境镉暴露人群尿液中小分子代谢产物表征差异研究 III 2.2 代谢组学数据处理平台代谢组学数据处理平台 采用 SPSS 13.0 进行秩和检验和 ROC 曲线绘制等；采用 MPP 12.1 进行色谱 峰的识别和前处理；运用 SIMCA-P 13.0 进行 PCA 和 OPLS-DA 分析，筛选 VIP 值较大的小分子代谢产物；通过数据库，对筛选的代谢产物进行鉴定。 3. 质量控制质量控制 现场调查人员经过统一培训，严格按照纳入排除标准选择调查对象；尿样、 大米和蔬菜在运输过程中保持冷链；各项指标检测均由
14、实验室相关专业人员承 担，测定前调试仪器稳定性，样品进样顺序随机，样品间穿插空白样和质控样， 要求质控样中内标物丰度及保留时间 RSD 小于 10%。 结果结果 1. 流行病学资料流行病学资料 1.1 人口学资料人口学资料 根据研究目的和纳入排除标准，本研究以 60 名女性为调查对象，暴露组与 对照组各 30 人，年龄分别为 55.36.99 岁和 59.77.52 岁。 1.2 调查对象外暴露水平调查对象外暴露水平 分析暴露组和对照组人群食用自产大米各 30 份，蔬菜各 30 份，与对照组相 比，暴露组米镉和菜镉含量增高，差异均具有统计学意义（P 0.05） ；对照组与暴露组人群尿 2-MG
15、 含量中位数分别为 0.04 mg/g.Cr 和 0.07 mg/g.Cr， 其差别无统计学意义 （P 0.05） 。提示与对照组人群相比，本研究中环境镉暴露组人群未见肾损害。 暨南大学硕士学位论文 环境镉暴露人群尿液中小分子代谢产物表征差异研究 IV 2.代谢组学分析代谢组学分析 2.1 检测系统的稳定性和精密度检测系统的稳定性和精密度 正离子模式（ESI+）下，QC 样中内标物丰度值和保留时间的 RSD 分别为 5.13%和 0.06%，负离子模式（ESI-）下分别为 2.00 %和 0.06%。提示该检测系 统的稳定性和精密度符合代谢组学分析要求。 2.2 模式识别模式识别 通过 HPL
16、C-Q/TOF 检测出两组人群尿液中有效代谢物共 2351 个；经非参数 检验，与对照组相比，暴露组人群尿液中有 139 个代谢物发生变化（P 0.05); And the median concentration of urinary 2-MG in exposed group and control group were 0.07 mg/g.Cr and 0.04 mg/g.Cr, respectively, the difference has no statistically significant (P 0.05). The 暨南大学硕士学位论文 环境镉暴露人群尿液中小分子代谢产物表征差异研究 IX results indicate that compare with the control group,
