变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)

《变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)》由会员分享，可在线阅读，更多相关《变性梯度凝胶电泳(DGGE)和温度梯度凝胶电泳(TGGE)（5页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。

1、变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳和温度梯度凝胶电泳（TGGE） 实验原理实验原理： 变性梯度凝胶电泳系统（denatured gradient gel electrophoresis，DGGE）最初是 Lerman 等人于 20 世纪 80 年代初期发明的，起初主要用来检测 DNA 片段中的点突变。Muyzer 等人在 1993 年首次将其应用于 微生物群落结构研究。 后来又发展出其衍生技术， 温度梯度凝胶电泳 （temperature gradient gel electrophoresis， TGGE） 。此后十年间，该技术被广泛用于微生物分子生态学研究的各个

2、领域，目前已经发展成为研究微生 物群落结构的主要分子生物学方法之一。 原理原理： 双链 DNA 分子在一般的聚丙烯酰胺凝胶电泳时，其迁移行为决定于其分子大小和电荷。不同长度的 DNA 片段能够被区分开， 但同样长度的 DNA 片段在胶中的迁移行为一样， 因此不能被区分。 DGGE/TGGE 技术在一般的聚丙烯酰胺凝胶基础上，加入了变性剂（尿素和甲酰胺）梯度或是温度梯度，从而能够把同 样长度但序列不同的 DNA 片段区分开来。一个特定的 DNA 片段有其特有的序列组成，其序列组成决定 了其解链区域(melting domain, MD)和解链行为(melting behavior) 。一个几百个

3、碱基对的 DNA 片段一般有 几个解链区域，每个解链区域有一段连续的碱基对组成。当温度逐渐升高（或是变性剂浓度逐渐增加）达 到其最低的解链区域温度时，该区域这一段连续的碱基对发生解链。当温度再升高依次达到各其他解链区 域温度时，这些区域也依次发生解链。直到温度达到最高的解链区域温度后，最高的解链区域也发生解链， 从而双链 DNA 完全解链。不同的双链 DNA 片段因为其序列组成不一样，所以其解链区域及各解链区域 的解链温度也是不一样的。当它们进行 DGGE/TGGE 时，一开始温度（或变性剂浓度）比较小，不能使 双链 DNA 片段最低的解链区域解链，此时 DNA 片段的迁移行为和在一般的聚丙烯

4、酰胺凝胶中一样。然 而一旦 DNA 片段迁移到一特定位置，其温度（或变性剂浓度）刚好能使双链 DNA 片段最低的解链区域 解链时，双链 DNA 片段最低的解链区域立即发生解链。部分解链的 DNA 片段在胶中的迁移速率会急剧 降低。因此，同样长度但序列不同的 DNA 片段会在胶中不同位置处达到各自最低解链区域的解链温度， 因此它们会在胶中的不同位置处发生部分解链导致迁移速率大大下降，从而在胶中被区分开来。然而，一 旦温度（或变性剂浓度）达到 DNA 片段最高的解链区域温度时，DNA 片段会完全解链，成为单链 DNA 分子，此时它们又能在胶中继续迁移。因此如果不同 DNA 片段的序列差异发生在最高

5、的解链区域时，这 些片段就不能被区分开来。在 DNA 片段的一端加入一段富含 GC 的 DNA 片段（GC 夹子，一般 30-50 个碱基对）可以解决这个问题。含有 GC 夹子的 DNA 片段最高的解链区域在 GC 夹子这一段序列处，它 的解链温度很高，可以防止 DNA 片段在 DGGE/TGGE 胶中完全解链。当加了 GC 夹子后，DNA 片段中 基本上每个碱基处的序列差异都能被区分开。当用 DGGE/TGGE 技术来研究微生物群落结构时，要结合 PCR（polymerase chain reaction）扩增技术，用 PCR 扩增的 16S rRNA 产物来反映微生物群落结构组成。 通常根

6、据 16S rRNA 基因中比较保守的碱基序列设计通用引物， 其中一个引物的 5-端含有一段 GC 夹子， 用来扩增微生物群落基因组总 DNA，扩增产物用于 DGGE/TGGE 分析。DGGE/TGGE 有两种电泳形式： 垂直电泳和水平电泳。前者是指变性剂梯度或温度梯度的方向和电泳方向垂直；后者是指两个方向是平行 的。在分析微生物群落的 PCR 扩增产物时，一般先要用垂直电泳来确定一个大概的变性剂范围或温度范 围。垂直电泳时，胶从左到右是变性剂梯度或温度梯度。在胶的左边，变性剂浓度或温度低，DNA 片段是 双链形式，因此沿着电泳方向一直迁移。在胶的另一边，由于变性剂浓度或温度高，DNA 一进入

7、胶立刻就 发生部分解链，因此迁移很慢。在胶的中间，DNA 片段有不同程度的解链。在变性剂浓度或温度临界于 DNA 片段最低的解链区域时， DNA 的迁移速率有急剧的变化。 因此， DNA 片段在垂直胶中染色后呈 S 形 的曲线，根据垂直电泳确定的范围，再用水平电泳来对比分析不同的样品。在用水平电泳分析样品之前， 先要优化确定电泳所需时间。一般采用时间间歇（timetravel）的方法，即每隔一定时间加一次样品，从而 使样品的电泳时间有一个梯度，根据这个结果，确定最佳的电泳时间。通过各种染色方法可以看到 DGGE/TGGE 胶中的 DNA 条带。 最常用的几种染色方法是溴化乙啶 （ethidiu

8、m bromide, EB） ， SYBR Green 为什么加G C 夹子，多大 原理 一般电泳区分： 不同大小和电荷 D G G E区分： 同样大小的不同序列 G C夹子的解链温度很高， 防止D NA 莲完全解开 而形成D NA 单链迁移 用于微生物区系分析 垂直和水平电泳 及其作用 时间间歇法确定 水平电泳时间 I, SYBR Gold 和银染法。EB 法染色的灵敏度最低。SYBR Green I 和 SYBR Gold 相比 EB，能更好地消 除染色背景，因此它们的检测灵敏度比 EB 法高很多。EB 和 SYBR 染色时，双链 DNA 能很好地显色， 单链 DNA 基本上不能显色。银染

9、法的灵敏度最高，它不但能染双链 DNA，也能染单链 DNA，但它的缺 点是不能用于随后的杂交分析。 PCR-DGGE/TGGE 在微生物生态学中的应用在微生物生态学中的应用： PCR-DGGE/TGGE 技术在微生物生态学中的一个主要用途是分析微生物群落结构组成 Muyzer 等人于 1993 年首次将该技术用于研究微生物菌苔和生物膜系统的群落多样性(50)。此后，该技术被广泛应用于各 微生物生态系统，包括土壤 ，活性污泥，人体和动物肠道，温泉，植物根系，海洋，淡水湖，油藏等。绝 大部分研究都是通过扩增细菌或古细菌的 16S rRNA 基因来研究各生态系统中的细菌或古细菌群落多样 性。 也有用

10、真菌的通用引物扩增 18S rRNA 基因 ， 从而研究真菌的群落多样性。 除了通过核糖体 RNA 基 因来分析微生物群落结构外，还可以通过扩增功能基因来研究功能基因及功能菌群的多样性。氨单加氧酶 （ammonia monooxygenase gene，amoA）基因被用来研究氨氧化菌群；NiFe氢化酶基因被用来研究硫酸 盐还原菌群；多组分苯酚羟化酶大亚基基因（the largest subunit of the multi-component phenol hydroxylase,LmPH）被用来研究降酚菌群。PCR-DGGE/TGGE 技术的另一大优点是能快速同时对比分析大 量的样品。因此

11、它既可以对比分析不同的微生物群落之间的差异，也可以研究同一个微生物群落随时间和 外部环境压力的变化过程。除了上述两个主要用途外，PCR-DGGE/TGGE 技术还有很多其他用途。它可以 跟踪监测细菌的富集和分离， 从而评价不同培养基及培养条件对分离菌种的影响； 可以检测单个纯菌 rRNA 基因的微异质性；可以用来比较不同的 DNA 提取方法；另外，它还可以辅佐筛选克隆文库以及检测 PCR 和克隆过程中的偏差。我们实验室用 PCR-TGGE 技术研究了多个微生物生态系统的微生物群落，包括处 理工业焦化废水的活性污泥系统，人体肠道，动物肠道（猪，熊猫，昆虫） ，人体口腔，纤维素降解土壤， 油藏系统

12、等。另外，我们还研究了处理工业焦化废水的活性污泥系统中苯酚降解菌群和氨氧化菌群的功能 基因多样性。 DGGE/TGGE 技术的缺陷及优化技术的缺陷及优化： 在用分子生物学方法分析微生物群落结构组成时，有很多偏差。不同细菌的基因组大小和核糖体 RNA 拷贝数不同；提取基因组总 DNA 时细胞的裂解效率不同；DNA 提取和纯化时有偏差；PCR 扩增过程中 有偏差。除了这些，在应用 DGGE/TGGE 技术分析微生物群落结构组成时还有很多其他的缺陷。 DGGE/TGGE 一般只能分析 500 个碱基对以下的 DNA 片段， 因此得到的系统进化相关的信息就很少。 在 研究复杂环境生态系统（如土壤，人体

13、肠道）时，其中微生物种类很多。但 DGGE/TGGE 图谱中一般只有 一二十个条带，这些条带反映的是群落中的优势菌群。一般只有在总的微生物群落中占 1%以上的种群才 能被检测出来，系统中的弱势菌群不能被检测到。为了降低分析群落多样性时的复杂度，一种方法是先根 据 GC 含量的不同，将基因组总 DNA 分成各个部分，再分别 PCR-DGGE/TGGE 分析。另一个方法是使 用类群特异性（group-specific）引物对基因组总 DNA 进行 PCR 扩增，再用于 DGGE/TGGE 分析。在设 计 PCR 引物去扩增某些特定菌群时，由于某些菌群的序列相互之间同源性不是很高，因此需要设计简并

14、性引物。此时，相同的微生物会有 2 个条带，这会对微生物群落结构组成造成高估。另外，同一个细菌也 可以有多个核糖体 RNA 操纵单元，它们的序列可以有微小差异，这也会高估微生物群落多样性。DGGE 的电泳条件不一样，即使相同的样品所得的图谱也会有差异。在应用 DGGE 时，如果所用电压太低，需要 的电泳时间就很长，变性剂梯度会有变化，因此导致图谱也会有变动。另外，DGGE/TGGE 的一个很大的 优点是可以对胶中所感兴趣的条带进行研究，得到它们的序列，从而可以直接获得和系统生态功能相关的 微生物种群的系统进化信息。以前研究 DGGE/TGGE 胶中单一条带序列组成的一个比较普遍的方法是先构 建

15、整个微生物群落的 16S rRNA 克隆文库，然后再对文库中的克隆进行扩增，通过 DGGE/TGGE 和原始样 品的条带进行对比，能迁移到相同位置处的克隆的序列就是原始条带所含的序列。然而，已有研究表明， 不同的 DNA 条带在 DGGE/TGGE 胶中可以迁移到相同的位置， 因此单一 DGGE/TGGE 条带可能含有不止 检测非含量低的微生物 的两种方法 一种序列。这种情形在分析复杂环境样品时会更多。另一个研究 DGGE/TGGE 胶中单一条带序列组成的方 法是直接从胶中回收 DNA，然后构建其克隆文库，再对其中的克隆进行测序。现在越来越多的研究人员采 用后一种方法。然而，PCR 过程中产生

16、的异源双链（heteroduplex）和单链 DNA（single-stranded DNA） 也会对分析单一条带序列造成偏差。 人们已经普遍意识到异源双链 DNA 会在 DGGE/TGGE 胶中产生虚假 条带，然而对单链 DNA 造成的偏差还没有引起足够的重视。我们实验室以某处理工业焦化废水的活性污 泥为研究对象，详细地分析了单链 DNA 在分析 TGGE 胶中单一条带序列组成时所造成的影响， 发现它会 大大高估单一条带中的序列多样性。另外，我们还对比了 3 种去除单链 DNA 的方法，发现变性聚丙烯酰 胺凝胶电泳(denatured polyacrylamide gel electrophoresis, d-PAGE)纯化的效果最好。我们建议在进行 DGGE/TGGE 电泳之前， 尤其是要分析单一条带序列时， 要先用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳对 PCR 产物进行 纯化，然后再走电泳。 变性梯度凝胶电泳变性梯度凝胶电泳 DGGE 操作步骤操作步骤： 1、将海绵垫固定在制胶架上，把类似三明治结构的制胶板系统垂直放在海绵上方，用分布在制胶架两侧 的偏心轮固定好制胶