《枳ptrice1、ptrhos1和ptrlos2基因克隆及ptrice1遗传转化研究》由会员分享，可在线阅读，更多相关《枳ptrice1、ptrhos1和ptrlos2基因克隆及ptrice1遗传转化研究（130页珍藏版）》请在金锄头文库上搜索。
1、分类号 密级 华中农业大学博士学位论文 I83l05S 枳P t r l C E I 、P t r H O S I 和P t r L O S 2 基因克隆及腭厂茫，遗传转化 研究 C l o n i n go fP t r l C E l ，P t r H O S la n dP t r L O S 2f r o mT r i f o l i a t eO r a n g e ( P o n c i r u st r i f o l i a t a 皿) R a f ) a n dG e n e t i cT r a n s f o r m a t i o no f P t r l C E l
2、 博士研究生：刘德春 指导教师：孙中海教授 指导小组：罗正荣教授 彭抒昂教授 李国怀教授 刘继红教授 胡春根教授 专业：果树学 获得学位名称：农学博士 研究方向：果树生物技术 获得学位时间：2 0 1 0 年6 月 华中农业大学园艺林学学院 二。一。年六月 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 删删f l f f f J | I f Y 18 0 5 3 3 7 ” 学位论文 西 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他入已 经发表或撰写过的研究
3、成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位 或证书而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究 所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：女l 德春 时间：山。口午歹月日 籼椭签名椭。名： 签名日期：办c 矿年歹月日 签名日期：跏恼年，月 日 注：请将本表直接装订住学位论文的扉页和目录之问 枳P f ，( Z ，、尸卅7 G 哼，和P t r L O S 2 基因克隆及P t r l C E I 遗传转化研究 目录 摘要I A B S T R A C T I l I 缩略词表V I 第一章前言。l l 课题的提出1 2 植物抗寒研究进展
4、。3 2 1 植物受低温胁迫时的生理反应3 2 1 1 植物形态和解剖结构与抗寒性的关系3 2 1 2 植物细胞膜结构与抗寒性的关系3 2 1 3 植物保护酶系统与抗寒性的关系5 2 1 4 渗透调节物质与植物抗寒性的关系5 2 2 植物响应低温胁迫的分子机理7 2 2 1 不依赖A B A 的低温响应基因表达调控途径。7 2 2 1 1 I C E l - C B F D R E B I 调节单元。8 2 2 1 1 1C B F D R E B l 转录因子一8 2 2 1 1 2I C E I 转录因子l O 2 2 1 1 3I C E I 蛋白的修饰和调控1 2 2 2 1 1 4I
5、 C E I - C B F D R E B | 调节元的抑制因子1 4 2 2 1 2 非I C E l C B F D R E B l 调节元的低温响应基因。1 4 2 2 2 依赖A B A 的低温响应基因表达调控途径1 5 2 3 植物的抗寒基因工程研究进展1 7 2 3 1 低温响应基因的遗传转化1 7 2 3 2 植物抗冻蛋白的遗传转化。1 8 2 3 3 氧化胁迫相关基因的遗传转化。1 8 2 3 4 脂肪酸去饱和酶基因的遗传转化1 9 3 本研究的目的和意义1 9 第二章枳P t r l C E l 基因的克隆、表达及功能分析2 l l 材料与方法2 l 1 1 试验材料。2l
6、 1 2 菌株与质粒载体。2 2 1 3 酶与试剂盒2 2 1 4 引物合成2 2 2 实验方法。2 3 2 1 试验材料的准备一2 3 2 2 枳P t r l C E J 基因克隆2 3 2 2 I 植物总R N A 的抽提2 3 2 2 2R N A 质量检测与浓度测定2 4 2 2 3 第一链c D N A 合成2 4 2 2 4P C R 扩增获得P 纠C E J 基因片段2 4 2 2 5P C R 产物的同收、纯化。2 5 2 2 6 同收纯化的目的片段与克隆载体的连接2 6 2 2 7 大肠杆菌感受态的制备2 6 2 2 8 连接产物的转化及重组质粒的蓝白斑筛选2 6 2 2
7、9 尸，! ，C E ，基因片段测序2 7 2 2 103 R A C E 。2 7 2 2 1 l 序列拼j ! 融：2 8 2 2 1 2 完整的O R F 克隆2 8 华中农业大学2 0 1 0 届博士学位论文 2 3 生物信息学分析一2 9 2 4P t r l C E l 基因在不同的逆境下的表达模式分析2 9 2 5 枳P t r l C E 基因超表达载体构建3 0 2 5 1 小量法提取质粒D N A 3 0 2 5 2 超量表达载体的构建3 0 2 6 根癌农杆菌介导的烟草遗传转化一3 2 2 6 1 根癌农杆菌感受态的制备( C a C l 2 法) 3 2 2 6 2 工
8、程菌的制备。3 3 2 6 3 试剂和培养基配制3 3 2 6 4 根癌农杆菌介导的叶盘法转化烟草3 3 2 7 转基因烟草K m 抗性植株P C R 检测3 4 2 7 1 转基因烟草基因组D N A 提取3 4 2 7 2 转基因烟草P C R 检测3 5 2 7 3 转基因烟草半定量P C R 检测3 5 2 8T l 代转基因和野生型烟草的获得和筛选。3 5 2 9 冷处理后T l 代转基因和野生型烟草存活率的测定3 5 2 1 0 冷处理后T l 代转基因和野生型烟草表型观测一3 6 2 1 l 相对电导率的测定3 6 3 结果与分析3 6 3 1P t r l C E J 基冈的克
9、隆及序列分析3 6 3 1 1 尸t r i C E ，基囚e D N A 片段的克隆3 6 3 1 23 R A C E 3 6 3 1 3P t r l C E l 完整的O R F 的克隆和分析3 6 3 2 冷和A B A 处理后P t r l C E l 的表达模式4 0 3 2 1 冷胁迫下凡C E J 的表达模式4 0 3 2 2A B A 胁迫下P t r l C E J 的表达模式4 l 3 3P t r l C E l 基因超表达载体的构建4 2 3 3 1P t r l C E ，插入p M D l 8 一T 载体方向的确定4 2 3 3 3T 4 连接酶连接p M V 载体大片段和目的基因小片段4 3 3 3 4p M V I C E l 转化农杆菌4 4 3 4 烟草转基因植株的获得4 5 3 4 1 根癌农杆菌介导的烟草转化4 5 3 4 2T o 代转基冈烟草的P C R 检测4 6 3 4 3T 0 代转基冈烟草的半定量R T - P C R 检测4 7 3 4 4T 0 代转基冈烟草与野生型烟草的表型差异4 8 3 4 5T 。代转基因烟草的获得和K m 抗性筛选4 9 3 4 6 冷处理后T l 代转基冈烟草与野生型烟草的膜透性差异4 9 3 4 7 冷处理后T ，代转基冈烟草与野生型烟草的存活率差异
